细胞工程第9章 转基因动物与动物生物反应器

1转基因动物与动物生物反应器TransgenicAnimalsandMammaryGlandBioreactor1转基因动物的制备方法2转基因动物的应用3乳腺生物反应器4基因打靶2转基因动物基因工程技术胚胎工程技术转基因动物（transgenicanimal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。转基因动物3转基因动物的命名原代转基因动物:founderG0G1G2拟人化命名41982年,Palmiter生产超级小鼠

世界上第一只转基因动物:转入了生长激素基因的巨鼠（supermouse）

5哺乳动物转基因技术的主要环节1目标基因克隆和体外重组2外源基因的导入3外源DNA整合、转录及表达的分子检测4转基因动物品系或品种的建立

61转基因哺乳动物的制备方法显微注射法逆转录病毒载体感染精子载体介导法胚胎干细胞介导法细胞核移植技术YAC介导的基因转移

71.显微注射法

操作程序如下：首先，向供体母鼠注射孕马血清，48小时后再注射人绒毛膜促性腺激素，使其超排卵（排卵数可达25枚）。然后，将此鼠与雄鼠交配获取受精卵，随后将构建的外源基因在体外用显微注射器注射到受精卵的卵原核中。显微注射完成后，将受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，大约3周后，代孕母鼠产下转基因鼠。89MicroinjectionintothePronucleus10

克隆DNA供体母鼠酶解、分离、纯化、定量注射激素（PMSG，HCG）与雄鼠交配目的基因DNA片段鼠受精卵

显微注射（卵原核中）注射DNA的受精卵输卵管移卵假孕母鼠

表型分析胎鼠组织或幼鼠尾巴取出鼠胚胎或待娩幼鼠

制备DNA

外源基因的整合检测

确定转基因鼠传代转基因鼠显微注射法建立转基因鼠的一级实验程序？？？11显微注射法的优点：

a、转移率较高、整合效率达30%；

b、外源基因长度可达数百Kb；

c、方法相对简单；

d、导入过程直观。12缺点：设备昂贵、操作复杂；随机整合、首尾相连的多拷贝；转基因效率较低；常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。132．逆转录病毒载体感染法

原理：利用携带外源基因的逆转录病毒感染胚胎是最早使用的动物转基因方法之一。其基本原理足当逆转录病毒的RNA进入细胞后，逆转录成DNA(DNA前病毒)，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA前病毒可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。

14逆转录病毒载体151617

逆转录病毒感染法特点优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。

缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA（≦10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。181920PronuclearMicroinjectionSubzonalMicroinjection21SubzonalMicroinjection22卵周隙显微注射示意图(Reference:NatureProtocols,2006,1(1):288)

23慢病毒可克服以往的逆转录病毒的缺点—

基因沉默现象用慢病毒感染小鼠ES细胞，有效地将外源基因导入ES细胞中，并且外源基因在ES细胞的不同分化阶段得到有效地表达；将慢病毒感染的ES细胞注射到小鼠的囊胚中，移植后产生在众多组织中均表达外源基因的嵌合体后代。从嵌合体获得的胚胎也表达外源基因；用慢病毒感染胚胎得到稳定的转染及外源基因有效的表达，移植后产生有效表达外源基因的后代。证明慢病毒可克服以往的逆转录病毒的缺点——

基因沉默现象，而成为一个制备转基因动物的较好的工具。244、胚胎干细胞法

25ESC法是在基因组相应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA定向整合到内源基因组中表达。将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。一般程序如下：26

获得功能基因

构建基因打靶载体转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系

制备嵌合体

筛选进入生殖系小鼠

转基因小鼠（F1）表型分析

选择单系同胞交配产生（F2）代

筛选纯合子的转基因小鼠

胚胎干细胞法建立转基因鼠的一级实验程序27与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特的优势：

（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动物生产中发挥着极为重要的作用。2829基因打靶305、体细胞克隆转基因技术平台3132Clonedsheephashumangene

POLLY33Korea：Productionoftransgenicclonedpigs

transgenicclonedpigswiththegreenfluorescentprotein

(GFP)onJune8,2003.342转基因动物的应用（1）动物品种改良；（2）生物制药(乳腺生物反应器)；（3）建立人类疾病的动物模型；（4）生产可移植用的动物器官；（5）基因治疗(动物模型)；（6）基因打靶。35（1）动物品种改良抗病育种生长性状36（3）建立人类疾病的动物模型

已建立的部分人类疾病的转基因动物模型_____________________________________________疾病模型基因转移方法转导的基因______________________________________________________老年性痴呆征显微注射β淀粉样蛋白基因Ⅱ型糖尿病显微注射胰岛淀粉样多肽基因β地中海贫血症显微注射人β珠蛋白基因镰刀形细胞贫血症显微注射人α和β珠蛋白基因唐氏综合症显微注射Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤反转录病毒转染HIVtat基因成骨不全症显微注射突变的α1胶原蛋白前体基因自毁容貌症ES细胞同源重组突变HGPRT基因_____________________________________________374）生产可移植用的动物器官猪的脏器移植给人，会发生超急性排斥反应。转基因技术生产能降低或掩盖半乳糖基转移酶活性的转基因猪。如何用细胞工程解决移植器官的来源问题?(2002).Science295,1089–109238（5）基因治疗

上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治愈。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。

3940卵周间隙显微注射受精卵移植鉴定转基因小鼠4142（6）基因打靶基因打靶技术(Genetargeting)是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上,定向改变生物活体遗传信息的实验手段。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代43基因打靶的研究意义基因功能研究人类疾病动物模型的研制经济动物遗传物质的改良44三个主要环节打靶载体的构建靶细胞转染与筛选由中靶细胞制备转基因动物45基因打靶技术根据打靶细胞的不同，基因打靶主要分为:1胚胎干细胞介导的基因打靶技术2体细胞克隆介导的基因打靶技术46胚胎干细胞介导的基因打靶技术

首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。47体细胞克隆介导的基因打靶技术家畜的体细胞克隆技术已取得突飞猛进的发展，为转基因动物的生产提供了一条新途径。直接在体细胞中进行基因同源重组，体外筛选中靶细胞，再以之为核供体获得转基因后代，是当前家畜基因打靶的一条有效途径。但是，由于体细胞体外培养的有限性和同源重组概率低，使体细胞克隆途径的基因打靶效率比胚胎干细胞途径大为降低。48基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)4950基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种51正负双向选择系统

(positive-negative-selection,PNS)

同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。52

胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。53实验流程

542007年生理学或医学奖诺贝尔奖美国犹他大学Eccles人类遗传学研究所科学家MarioR.Capecchi、美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院教授OliverSmithies与英国科学家卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院MartinJ.Evans因胚胎干细胞和基因打靶研究获得此奖项。

55563乳腺生物反应器

Mammaryglandbioreactor:

ProteinFactoryoftheFuture

1987年美国科学家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白──tPA（组织型纤溶酶原激活物），展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为动物乳腺反应器。57转基因山羊--活动的制药厂

Mammaryepithelialcells58

如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。59动物多肽药物用途绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿绵羊CFTR治疗囊肿性纤维化绵羊组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓绵羊凝血VIII因子、IX因子治疗血友病绵羊纤维蛋白原伤口愈合猪组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓猪凝血VIII因子、IX因子治疗血友病山羊人蛋白质C治疗血栓山羊抗血栓因子3治疗血栓山羊谷氨酸脱羧酶治疗I型糖尿病山羊Pro542治疗爱滋病牛a-乳清白蛋白抗炎症牛凝血VIII因子治疗血友病牛纤维蛋白原伤口愈合牛胶原蛋白I,II组织修复,治疗风湿性关节炎牛乳铁蛋白治疗肠道感染,感染性关节炎牛人血清白蛋白维护血液体积鸡,牛,山羊单克隆抗体用于疫苗生产60动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中的表达，并从转基因动物的乳汁中获取重组蛋白。61表达载体的构建目的基因的选择体外重组基因转导胚胎移植鉴定62优点一：产出高产品活性高：一头奶牛一年可产奶8000～10000升，而一只绵羊和山羊也可产奶800～1000升，以最低表达量1克/升的重组蛋白计算（即转基因动物奶液中重组蛋白的含量，一般为1～20克