多重耐药铜绿假单胞菌β-内酰胺类相关耐药基因研究

多重耐药铜绿假单胞菌β－内酰胺类相关耐药基因研究【摘要】目的调查我院2005年临床分离多重耐药铜绿假单胞菌(PA)的耐药性分析并探讨其耐药基因的存在状况。方法对31株临床分离的铜绿假单胞菌用纸片扩散法检测其药敏表型，采用聚合酶链反应(PCR)法检测β-内酰胺酶编码基因和外膜通道蛋白OprD2基因，并与相关药敏表型比较。结果31株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的耐药率为48．4%~100%；β-内酰胺酶编码基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的检出率分别为6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未检出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，检出率为100%。结论本院多重耐药铜绿假单胞菌对β-内酰胺酶类抗生素的耐药主要与外膜通道蛋白OprD2基因缺失有关。

【关键词】铜绿假单胞菌；多重耐药；β-内酰胺酶；聚合酶链反应；基因型

【Abstract】ObjectiveTosurveythedistributionofaminoglycoside-modifyingenzymegenesinmultidrug-resistantpseudomonasaeruginosaisolatedinourhospitalin2005．MethodsTheantibioticsusceptibilityof31differentantibioticsofwastestedbyK-Bmethod，and31multi-drugresistantstrainswerescreened;β-lactamasegenesandtheoutermembraneproteinOprD2geneweredetectedbypolymerasechainreaction(PCR).ResultsResistantratesof31strainsofagainst16kindsofantibioticrangedfrom48．4%to100%;thedetectionrateofβ-lactamasegenePER，VIM，DHA，IMP，TEMandOXA-10was6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and3．2%respectively，andnoneofthe31strainspossessedgenesofGES，SHVandVER，31isolateofPAlosttheoutermembraneproteinOprD2Resistancetoβ-lactamcompoundsinofourhospitalisrelatedtolosttheoutermembraneprotein.

【Keywords】Pseudomonasaeruginosa;Multidrugresistance;β-Lactamases;Polymerasechainreaction;Genes

铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，PA)是一种重要的条件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血症、肺炎、泌尿系统感染、烧伤感染和囊性纤维化继发感染等多种疾病。2002年全国细菌耐药性监测网调查显示：PA的分离率为10．3%，仅次于大肠埃希菌而居第二位[1]。由于临床上抗生素的大量使用，铜绿假单胞菌呈现出天然或获得性多重耐药性(multidrugresistance，MDR)，给治疗造成困难。近年来，铜绿假单胞菌对3、4代头孢和亚胺培南在内的多种β内酰胺类抗生素及氨基糖苷类抗生素耐药率一直处于一个比较高的水平，并呈现逐年上升的趋势[1-3]。为了解临床分离多重耐药的PA中耐药情况，收集了本院2005年1~12月临床分离的31株PA，对其进行耐药性的检测，并采用分子生物学技术检测其耐药相关基因，结果报告如下。

1材料

1．1菌株来源于本院2005年1~12月临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌(MDRP)31株。所有标本均采用法国生物梅里埃公司细菌鉴定仪鉴定菌种。

1．2质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853均购自卫生部临床检验中心。

1．3MH培养基采用英国Oxoid公司产品。

1．4抗生素及药敏纸片头孢他啶(30μg/片，CAZ)、头孢曲松(30μg/片，CRO)、亚胺培南(10μg/片，IMP)、克拉维酸(2mmol/L，CA)、氯唑西林(2mmol/L)、美罗培南(10μg/片，MER)、2-巯基丙酸纸片均购自英国Oxoid公司。

1．5微生物鉴定系统VITEK-32法国生物梅里埃公司产品。

1．6仪器DNA扩增仪为美国PE公司产品。

1．7PCR检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

2方法

2．1细菌培养、鉴定和保存细菌培养根据临床检验操作规程按常规方法进行，采用VITEK-32全自动微生物鉴定系统鉴定结果；将细菌接种于半固体培养基中，37℃培养24h后置-80℃冰箱保存，以备进行分子学检测。

2．2抗生素敏感试验采用纸片扩散法(K-B法)，结果根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)2004年版标准进行判断。

2．3PCR扩增模板制备挑取菌落置入含100μl生理盐水的0．5ml离心管内，15000转/min离心5min，去上清。加0．05%非离子去污剂NP4050μl、200ng/ml的蛋白酶K2μl混匀，55℃水浴1h，然后95℃水浴5min，最后10000转/min离心30s，取上清做PCR扩增的模板。

2．4基因检测均为PCR法。PCR扩增产物500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循环35个周期，最后一个72℃延长至5min，其余均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35个周期，最后一个72℃延长至5min。各种靶基因的目的产物长度见表1。

2．5扩增产物检测扩增产物在1．5%琼脂糖凝胶(含0．5μg/ml溴化乙锭)120V电泳30~40min，全自动凝胶图像成像仪观察，出现与阳性模板分子量相同的条带即为阳性，PCR检测阳性对照DNA，由无锡市克隆遗传技术研究所微生物DNA收集与保存室提供，扩增条件同上。

3结果

3．1药敏试验结果31株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的药敏率见表2。

3．2基因检测结果β内酰胺酶编码基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的检出率分别为6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未检出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，检出率为100%。

4讨论

研究发现，PA对β内酰胺类抗生素存在多种耐药机制，如外膜渗透性降低、泵出机制、由染色体编码持续高产AmpC酶、产超广谱β内酰胺酶以及能水解卡巴培能碳氢酶烯的金属酶等。IMP是目前用于治疗革兰阴性杆菌感染具有最强抑菌效能的抗生素，对产ESBLs及AmpC酶的革兰阴性杆菌均有效。IMP耐药的PA在临床上具有更大的危险性。

近年来随着研究的深入，国内外学者在PA菌临床分离株中发现了多种β内酰胺酶和碳青霉烯酶基因如TEM、SHV[6，7]、OXA、VEB-1、PER[8，9]、GES、持续高产AmpC酶、IMP[10]、VIM[11]、SPM[12]等。在我国上海、杭州、石家庄、温州相继发现了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因[6，8，10]。这些基因所表达的产物可以水解青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类和碳青霉烯类抗生素。

本组菌株中，表型耐亚胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失为100%；VIM、IPM基因各发现1株，各占3．2%。PA对亚胺培南耐药的主要原因为产IMP、VIM、SPM、GIM型金属β-内酰胺酶、GES-2型β-内酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β内酰胺类抗生素对PA的作用靶位是细菌内膜上的PBP2，该类药物要达到其作用靶位必须首先经过外膜通道进入周浆间隙。如果菌株外膜蛋白通道减少或缺失，药物难以到达其作用靶位，细菌将产生耐药。因此，OprD2被认为是亚胺培南扩散的通道[11]。VIM、IMP是金属β-内酰胺酶，可快速水解青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗菌药物。通过本组实验研究可以表明PA对亚胺培南耐药的主要原因是特异性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，从而阻碍抗菌药物进入菌体内到达细菌作用靶位。

OXA、TEM、SHV、PER、GES阳性均可引起PA对β内酰胺酶类抗菌药物的广泛耐药。本组菌株中PER的阳性率为6．4%，TEM、OXA-10的阳性率为3．2%，而GES、SHV基因未检出，这些基因的阳性率与国内其他地区的检测结果有差别[6，8，10]。导致此种结果出现的原因应与本地区抗菌药物的使用情况有密切关系。

总之，PA的耐药机制极为复杂，它对某一类抗菌药物的耐药往往不是由单一因素造成，而常是几种机制协同作用的结果；它对不同抗菌药物的耐药机制也不完全相同，并不断有新的耐药机制出现。即使是同一种菌不同地区、不同时期其耐药性和耐药基因状况也不相同。本实验结果证明聊城地区的PA对各类抗菌药物均有不同程度的耐药性，且耐药基因阳性率较有报道的国内其他地区高。OprD2基因缺失应该是本组菌株耐药的主要原因，此情况应引起临床医生和院内感染科的高度重视，但也不排除同时存在其他耐药机制的可能，有待进一步研究。

参考文献

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