细胞增殖活性及原位检测

细胞增殖活性原位

检测(jiǎncè)技术及应用重庆(zhònɡqìnɡ)医科大学病理教研室叶秀峰第一页，共七十四页。精选ppt细胞周期（CellCycle)一、细胞周期概述概念(gàiniàn)：细胞周期是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程。

主要事件：遗传信息载体DNA复制，通过有丝分裂将两份拷贝DNA平均分配到两个子代细胞中第二页，共七十四页。精选ppt分期(fēnqī)：分为4个时期.即G1SG2M期第三页，共七十四页。精选ppt(一)Gl期(Gapphase)是指从有丝分裂完成到DNA复制之前这一阶段，包括．RNAs及蛋白的合成，所以又称复制前期或合成前期。这一时期细胞主要活动是为DNA的复制和蛋白质合成作准备，主要特点为：(1)各种细胞的G1期持续时间变化很大。这可能与细胞在此期增加质量有关。因此，连续增殖细胞的增殖率是受G1期细胞的平均(píngjūn)时间长度控制的，各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于G1期的长短。

第四页，共七十四页。精选ppt(2)此期发生了与DNA合成有关(yǒuguān)的事件，主要是RNA和蛋白质的合成。(3)RNA合成发生于G1早期，同时RNA聚合酶水平也迅速增高。(4)G1早期合成结构蛋白和酶蛋白等，G1后期合成与DNA复制有关的酶类，如胸苷激酶、脱氧核苷酸激酶等，其中DNA聚合酶活性在G1末期至S初期增高最快。(5)蛋白质磷酸化增加。组蛋白磷酸化增加使染色体解旋，以利于DNA复制；非组蛋白磷酸化增加可能与基因的活化有关。(6)染色体状态由凝集转变为解凝集，为DNA合成创造条件。(7)细胞膜转运功能增强。第五页，共七十四页。精选ppt(二)S期(synthesisphase)即DNA合成期或复制期，S期主要是DNA合成(自我复制)、遗传物质从二倍体(2n)到四倍体(4n)的整个过程。其中(qízhōng)主要的生物化学改变是遗传物质的复制，即．DNA的复制及组蛋白、非组蛋白等染色体蛋白的合成。由于每一条染色体复制成两条染色单体，在S期末，DNA含量增加一倍。DNA的准确复制保证了分裂后子细胞遗传物质的平均分配。DNA合成的同时，形成新的染色质的另一重要成分组蛋白的合成也同时进行。第六页，共七十四页。精选ppt(三)G2期(Gap2phase)指DNA复制完成到有丝分裂开始这段时间，这段时间内细胞有2套二倍体染色体，所以(suǒyǐ)又称复制后期或合成后期。DNA复制完成后，细胞进入G2期。处于此期的细胞DNA合成已终止，但仍然进行着RNA和一定的蛋白合成，为细胞有丝分裂作准备。第七页，共七十四页。精选ppt(四)M期(mitosisphase)即有丝分裂期，细胞在M期进行分裂。M期又分为前期、前中期、中期、后期、末期。M期的末期一结束，就形成两个新的子细胞，一次细胞周期即告结束，细胞就进入下一个细胞周期的G1期。细胞有丝分裂是一个复杂的过程，必须在DNA复制完成(wánchéng)后，细胞才能进行有丝分裂。此期细胞呈球形，不很牢固地附在它生长的基质上。染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并再形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂而结束M期。第八页，共七十四页。精选ppt第九页，共七十四页。精选ppt有丝分裂是一个核改组的连续过程(guòchéng)，根据形态学特征可分为5个阶段：前期(prophase)前中期(earlymetaphase)中期(metaphase)后期(anphase)末期(telophase)第十页，共七十四页。精选ppt1．前期这一期主要发生染色体凝集、分裂极的确定、核仁解体及核膜消失。2.前中期主要变化是纺锤体的形成和染色体排列在赤道面上形成赤道板。3．中期从染色体排列到赤道面上到两条染色单体(子染色体)开始趋向(qūxiàng)两极，这段时期称为中期。中期的染色体浓缩成典型形态，在赤道面上形成赤道板。第十一页，共七十四页。精选ppt4．后期后期是姐妹染色单体分开并移向两极的时期，当子染色体到达两极时，此期结束。染色单体的分开通常由着丝点开始，即两个着丝点先分开，然后两个染色单体的臂逐渐(zhújiàn)分开，完全分开后就向两极移动。

5．末期从子染色体到达两极后开始到形成两个子细胞这段时期称为末期，包括子核的形成与胞质分裂两个过程。第十二页，共七十四页。精选ppt二、细胞周期的控制点细胞周期能够顺利地发生、发展和完成，取决于三个重要的控制点(controlpoint)，即决定G1期发生的G1控制点，决定S期发生的S控制点和决定M期发生的M控制点。每一个控制点控制着细胞周期一定阶段的开始，但只有在细胞周期前一个阶段彻底完成以后才能发生。(一)G1控制点:在G1期，哺乳动物细胞的趋向有3种可能性：一些细胞进入S期，通过G2期及有丝分裂期，即进入增殖周期；一些细胞离开细胞周期，处于静止期，又称G0期，它们在一定的条件刺激(tiáojiàncìjī)下可重新进入增殖周期；第十三页，共七十四页。精选ppt还有一些细胞向分化方向发展，使细胞的功能向专一化，而分裂能力趋向减弱。

在正常情况下多细胞的哺乳动物体内(tǐnèi)的部分细胞处于非增殖状态的休止期(Go期)，只在一定条件下才进人G1期。在G1期的后期中存在一个类似于酵母周期中起始点的限制点(restrictionpoint，简称R点)，它在细胞的每一次分裂中具有控制作用，故称为G1控制点，只有通过R点的细胞才能进入S-G2-M期。

第十四页，共七十四页。精选ppt在通过R点前必须合成(héchéng)一种不稳定的蛋白质(p105RB)，当它积累到一定量时才能通过R点而启动DNA合成(héchéng)。因为一旦启动DNA合成(héchéng)后就可通过G2期而进入M期，所以R点是控制细胞增殖的关键，由此出发，细胞可能有3种不同的命运：

(1)继续增殖细胞。这些细胞在分裂完成之后，可以超过R点继续向前发展，它们不断离开G1期，并通过细胞增殖周期中的各个不同时期完成细胞分裂。如骨髓干细胞，胃、肠上皮中的基底细胞等。第十五页，共七十四页。精选ppt(2)暂时不增殖细胞。这类细胞在分裂完成后，暂时处于G。期，并在R点被阻留很长时间。在正常情况下，这类细胞不合成(héchéng)DNA也不分裂，但在一定条件下可再进入细胞周期而进行增殖。属于这种类型的有肝细胞、哺乳动物的初级卵母细胞等。(3)不增殖细胞。这类细胞可以由R点走向分化细胞，并成为执行专门功能的终末分化细胞。如神经细胞、哺乳动物的成熟红细胞、皮肤上皮的角质细胞等。第十六页，共七十四页。精选ppt(二)S控制点细胞在G1期完成后，细胞质中含有DNA复制的激活因子，叫S期激活因子(Sphaseactivator)。S期激活因子的量决定Gl期完成和细胞进入S期的速度。DNA复制完成后，细胞结束S期进入G2期，某些细胞可停在G2期，在适当的条件下进入M期重新分裂。(三)M期控制点细胞开始有丝分裂(yǒusīfēnliè)时需要M期激酶(Mphasekinase)激活。M期激酶是由2个亚单位第十七页，共七十四页。精选ppt组成，一个是催化亚单位p34；另一个是调节亚单位，它是一种细胞周期蛋白(cyclin)，可以是周期蛋白A或周期蛋白B，它们是在有丝分裂间期不断合成并积累的。

p34本身没有活性，当它与调节亚单位结合时，通过调节亚单位变构形成p34-cyclinA或p34-cyclinB二聚体。二聚体中的p34蛋白丝氨酸与苏氨酸残基去磷酸化，产生激酶活性位点，使细胞进入M期。在M期中，调节亚单位被破坏，使M期激酶失活，从而(cóngér)使分裂的两个子细胞分开，结束M期。第十八页，共七十四页。精选ppt

第二节细胞周期的调控目前，人们已揭示了细胞周期的主要生物化学过程，并获得了自酵母至人类普遍(pǔbiàn)适用的模式。一．细胞因子与相应的受体细胞因子是一类能与特异的、高亲和性的细胞外基质、可溶性受体及细胞膜上的受体结合，向细胞内传递信号，刺激细胞增殖的多肽类物质。生长因子为一类促进细胞生长的细胞因子。根据生长因子的靶细胞的不同，可将其第十九页，共七十四页。精选ppt

分为两类：一类为具有广泛作用(zuòyòng)的生长因子，如表皮生长因子(EGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)和转化生长因子β(TGF-β)等；另一类为细胞特异性生长因子，如白细胞介素2(IL-2)、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等。正常情况下，哺乳动物体内的大部分细胞处于非增殖状态的G0期，此期细胞主要表达与细胞生长有关的基因，但不合成与细胞周期调控体系有关的蛋白。细胞因子作用于细胞表面的各种相应的受体，受体多是增殖信号的跨膜传递者。这些受体都是糖蛋白，和生长因子结第二十页，共七十四页。精选ppt

合后产生变构，激活了蛋白激酶的活性，可使细胞内靶蛋白的酪氨酸发生磷酸化，进一步触发由细胞质到细胞核的一系列信号传递反应。核内调控蛋白接受从细胞质经一系列反应传来的增殖信号后，才能变构而被激活，与基因组中特定的调控序列发生相互作用，开动一组与细胞增殖调控有关的特定基因的转录，首先刺激fos、jun、myc等早期(zǎoqī)反应基因的表达，并在这些转录因子的作用下，激活周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶

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的基因表达，合成与细胞周期调控体系有关的蛋白，调控细胞周期的进行。下面介绍几种主要的生长因子及受体:(一)表皮生长因子EGF是一种含有53个氨基酸残基的多肽。EGF分子内有对维持其生物活性必需的3个二硫键，当用巯基乙醇或尿素还原二硫键后，EGF活性就会丧失。EGF主要分布于人的尿液、乳汁和血浆(xuèjiāng)中。作为一种作用很强的促细胞分裂因子，EGF能刺激多种组织细胞在体内和体外的分裂和增殖。EGF是通过位于细胞膜上的受体而发挥其生物学效应的。EGF受体第二十二页，共七十四页。精选ppt(EGFR)是具有内在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，EGFR的分布较广泛，来源于内、中、外三个胚层的细胞均有EGFR表达。EGF与EGFR结合后形成复合物，通过细胞内吞进入细胞，在细胞内EGF最终被溶酶体降解(jiànɡjiě)，EGFR在与EGF解离后被送回质膜表面重新利用。(二)血小板衍化生长因子血小板衍化生长因子(platelet—derivedgrowthfactor，PDGF)来源于血小板，由含二硫键的二聚体组成，PDGF也是一种较强的促有丝分裂因子。第二十三页，共七十四页。精选pptPDGF以启动性生长因子的身份，刺激静止细胞进入对推进因子敏感的状态，离开G0期进入生长周期。反转录病毒的转化基因v-sis的产物P28V-sis蛋白质氨基酸的顺序(shùnxù)与PDGF的β链同源，这说明癌基因可能通过编码生长因子参与细胞增殖调控。PDGF也是通过与细胞表面的特异性受体结合发挥作用的。PDGF受体(PDGFR)是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，通过与PDGF结合被活化，发挥多种生理活性。第二十四页，共七十四页。精选ppt(三)转化(zhuǎnhuà)生长因子转化生长因子(transforminggrowthfactor，FGF)是一组诱导非瘤细胞表达转化表型的多肽类物质。FGF中最主要的有TGF-α和TGF-β两大类。TGF-α在结构上与EGF相关，生物学特性非常相似。TGF-α和EGF都能与EGFR结合，结合后均可活化EGFR的蛋白激酶活性并诱导受体对信号传导链下游的调节作用。TGF-β不与EGFR结合，其受体是含二硫键的糖基化复合物。TGF-β的转化活性需EGF或TGF-α的协同。TGF-β对于各种肿瘤细胞。第二十五页，共七十四页。精选ppt

如上皮细胞、胚胎成纤维细胞及大鼠的原代培养均为一种抑制增殖作用。因此，TGF-β可能主要是参与抑制细胞增殖。对细胞生长起负调节作用。(四)抑素抑素(chalone)是与生长因子(yīnzǐ)作用相反的、具有组织特异性的内源性、生理性生长抑制因子(yīnzǐ)，其作用有组织或细胞特异性，而无种属特异性。对细胞无毒性，仅使细胞增殖阻滞于细胞周期某一时相，作用消失后，细胞增殖可被逆转。第二十六页，共七十四页。精选ppt抑素是肽类、蛋白质或与糖结合的复合体，水溶性，存在于组织细胞和血清内。目前确定的抑素有表皮细胞抑素、肝细胞抑素、红细胞抑素、中性粒细胞抑素、淋巴细胞抑素等。各种抑素的分子量和理化性质不同，其分子水平的作用尚不清楚。目前认为抑素主要作用于G1～S期，阻止细胞进入S期的称为(chēnɡwéi)G1抑素或S因子，阻止细胞进入M期的称为G2抑素或M因子。第二十七页，共七十四页。精选ppt二、周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶对细胞周期的调控(一)周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶过去人们一直认为细胞周期受核的控制，细胞质的活动是被动的。但研究发现，细胞质中存在有调节细胞周期的因子，其活动不完全受细胞核的控制，这种因子被称为有丝分裂促进(cùjìn)因子(mitosispromotingfactor，MPF)。MPF由两种蛋白分子组成，一种是“周期蛋白”(cyclin)，另一组分是具有蛋白激酶活性的催化亚单位，由于此激酶的活性依赖于和周期第二十八页，共七十四页。精选ppt蛋白结合，又称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin—dependentkinase，CDK)。

已发现的周期蛋白有10多种，如酵母细胞中的Clnl、Cln2、Cln3及哺乳动物细胞中的CyclinA、B、C、D、E、F、H等。依据它们在细胞周期中调控阶段的不同(bùtónɡ)分别归人G1期周期素和M期周期蛋白。在周期蛋白分子中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是与CDK互相结合的关键区，称“周期蛋白盒”(cyclinbox)。周期蛋白周期性地合成、与CDK结合、降解，起到了对细胞周期的调节作用。第二十九页，共七十四页。精选pptCDK是具有蛋白激酶活性的催化亚单位。目前已发现6种CDK。CDK与细胞分裂周期(celldivisioncycle，cdc)基因(jīyīn)cdc2编码产物p34cdc具有同源性。与周期蛋白结合的p34cdc的活性还受其他某些特异性的激酶和磷酸酶的调控。包括Cdc2(CDKl)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK6，它们分别对细胞G1-S期和G2-M期的过渡进行调控。第三十页，共七十四页。精选ppt当细胞进入G2期后，M期cyclin逐渐增加，并与CDK形成无活性MPF复合物，在其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，转变为MPF。通过MPF对这两类酶的正反馈调节作用，不断加速MPF的产生。当MPF增加到相当高的浓度时就引发一系列变化。(二)细胞周期蛋白(dànbái)对细胞周期的调控1.G1期周期蛋白正常情况下，哺乳动物体内细胞的G1期后期具有一个控制样的限制点，称为G1控制点。人类细胞在G-期表达3种周期蛋白：

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CyclinC、D和E。处于Go期的细胞受生长因子刺激后，首先表达C、D型周期蛋白，再表达E型周期蛋白，然后进入DNA合成期。CyclinC的水平在G0期稍有增加(zēngjiā)，在细胞周期的其他时期内波动很小。CyclinD在不断增殖的细胞中的水平波动不明显。CyclinD的表达对生长因子有明显的依赖性。在G0早期，D型周期素开始表达，并与CDK4为主的数种激酶结合，在细胞由Go期进入Gl的过程中起重要作用。如果抑制CyclinD在G0期的表达，细胞将不能进入s期。第三十二页，共七十四页。精选ppt

CyclinE的表达时间比CyclinD晚，在细胞内呈周期性表达，峰值在G1-S过渡点，在控制(kòngzhì)细胞由G1期进人S期起限速作用。当人类CyclinE在人包皮成纤维细胞中稳定地过渡表达时，可以缩短被转染细胞的G1间期，细胞在较小的状态通过G1-S期过渡点，并可减少由G1向S期过渡时血清的需要量，而CyclinE在周期中产生的时间并未改变；但是，由于细胞提前进入S期，影响了为复制DNA所需要的因子的积累，缩短的G1期的时间由延长s期和G2期得以补差平衡。由此可见，CyclinE的合成程度是细胞G1-S过渡的限制因素。第三十三页，共七十四页。精选ppt2．S期和M期的周期蛋白(1)CyclinA和CyclinB。CyclinA的合成(héchéng)早于CyclinB，它的合成(héchéng)起始接近于Gl-S期过渡点，并在间期就进入细胞核内。破坏CyclinA的功能将抑制染色体的复制。CyclinB的合成(héchéng)起始于S期，在G2-M期过渡中逐渐增加，直至有丝分裂中期和后期之间发生骤然降解。而且，CyclinB在核膜破裂前才进入细胞核内。CyclinA和CyclinB分别与CDK2和CDKl相结合，使细胞从G2期进入M期。第三十四页，共七十四页。精选ppt

(2)CyclinH。CyclinH与一种与CDK相关的激酶M015相结合，M015-CyclinH复合物能增强CDK2-CyclinA的激酶活性。因此，与其他已知的CDK—Cyclin复合物不同，MOl5一CyclinH复合物不是细胞周期次级反应中的有关成分，而是中心调控体系本身，提示细胞周期中心调控机制(jīzhì)中存在Cyclin—CDK的级联反应。第三十五页，共七十四页。精选ppt第三十六页，共七十四页。精选ppt第三十七页，共七十四页。精选ppt第三十八页，共七十四页。精选ppt第三节细胞增殖与肿瘤人类肿瘤的发生与癌基因激活和抑癌基因失活有关。目前发现，癌基因和抑癌基因作用的归结点在于对细胞周期的调控。肿瘤细胞周期的调控多表现为起正调控作用的Cyclin过度表达，而发挥(fāhuī)负调控作用的抑制因子CKI却常常失活。如在多数恶性肿瘤中都有CyclinD的过度表达或/和P21、P27低表达。细胞周期的监测点异常也可能导致细胞周期紊乱而癌变。特别是约半数以上恶性肿瘤中有分子警察P53的突变。第三十九页，共七十四页。精选ppt

第四节细胞增殖常用的检查方法

1.细胞核分裂计数核分裂象是细胞周期中惟一可以用形态学方法识别的时期(shíqī)，在普通光学显微镜下即能够进行。Baak提出核分裂的识别标准的为：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明区；核分裂象两侧或外周可见毛发样突起；胞浆嗜碱性。核分裂计数有高倍视野法(highpowerfields，HPF)和核分裂指数法(mitoticindex，MI)。

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高倍视野法在高倍(×400)下，随机选择多个视野(≥10)，分别观察并计数其中(qízhōng)的核分裂象，然后计算出每个HPF中核分裂象的平均值。由于不同型号的显微镜HPF的面积太小可能存在一定差异，且所测细胞的大小不同，单位面积内的细胞数亦不相同，该方法存在结果可比性和重复性较差的问题。第四十一页，共七十四页。精选ppt核分裂指数法:在目镜上加一单线状标尺，计数高倍(×400)视野下与标尺相交的细胞数(n)，该视野内细胞总数A=π(n／2)2。计数10个高倍视野，其中(qízhōng)第1、5、10视野按上述公式计算，3个视野细胞数之和除以3，乘以10，则为10个视野的细胞总数。以10个高倍视野的核分裂象数除以细胞总数，求得MI值。第四十二页，共七十四页。精选ppt第四十三页，共七十四页。精选ppt第四十四页，共七十四页。精选ppt第四十五页，共七十四页。精选ppt在不同肿瘤中，核分裂数多少的意义(yìyì)是不一样的。如：胃肠道平滑肌肿瘤：≤5/10HPF；良性或潜在恶性≥5/10HPF：恶性子宫平滑肌肿瘤：≥10/10HPF+异型性+肿瘤性坏死：恶性≥10/10HPF、无异型性、无坏死：潜在恶性胃肠道间质瘤：5/50HPF+肿瘤＞5cm：恶性第四十六页，共七十四页。精选ppt2.DNA合成情况的检测(jiǎncè)直接反映处于S期细胞的多少。可通过测定标记的DNA前体物质，如3H-去氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸类似物质5-溴-2脱氧尿苷（Bromodeoxyoridine,BrdU),应用放射自显影、免疫组化或闪烁测定仪、流式细胞仪定性或定量测定标记的细胞术。第四十七页，共七十四页。精选ppt3H标记胸腺嘧啶(mìdìnɡ)脱氧核苷掺人标记技术

3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺人标记技术(thymidinelabeling,3H-TdR)由Johnson等于1961年首次建立，是显示s期细胞的经典方法。用活细胞或新鲜组织与3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷孵育1～2h，有DNA合成能力的s期细胞将摄人3H—TdR合成新的DNA，通过放射自显影显示，可在显微镜下直接辨认s期细胞，计数全部细胞中s期细胞的百分率作为胸腺嘧啶脱氧核苷标记指数(thymidinelabelingindex，TLI)表示增殖活性。第四十八页，共七十四页。精选ppt操作步骤a.剪碎的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入培养基和3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷，在37℃的CO2培养箱中培养2h；b．集组织和细胞，PBS清洗后，10％福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；c.室内将脱蜡水化后的切片浸人感光乳胶(rǔjiāo)，然后在4℃的暗盒内曝光3天；d.在暗室内放射自显影的切片在显影液中显影，然后在定影液中定影；e.切片经苏木素伊红染色；f.计数2000～5000个细胞，计算阳性细胞的百分率，求得TLI。第四十九页，共七十四页。精选ppt应用:

3H-TdR标记技术自建立以来，已得到广泛应用。Iinden研究证实高TLI与乳腺癌术后早期复发、病理(bìnglǐ)分型及临床亚型有关，与其他预后指标相比，TLI是最有价值的。存在的问题:TLI只显示s期细胞数量，而未显示s期长短，因而可能出现细胞增殖速度慢而TLI增高的情况

第五十页，共七十四页。精选ppt由于肿瘤生长的异质性，对肿瘤组织取材的代表性不够亦会造成结果偏差；观察者的经验、计数细胞的多少、组织的新鲜程度以及放射性同位素的活性均可影响结果的可靠性；需要新鲜组织及放射性同位素是TLI应用受限的主要(zhǔyào)原因。第五十一页，共七十四页。精选ppt溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术(5-bromodeoyuridine，Brdu)由于3H-TdR标记技术需要同位素，推广受限。5一溴脱氧尿嘧啶核苷(5一bromodeoyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶核苷的相似物，像胸腺嘧啶脱氧核苷一样可掺人到细胞(xìbāo)合成的DNA中，掺人到细胞(xìbāo)DNA的Brdu可通过抗5一Brdu单克隆抗体在组织切片和细胞(xìbāo)爬片上显示或通过FCM检测s期细胞(xìbāo)。第五十二页，共七十四页。精选ppt操作步骤a.剪成0.5mm3大小的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入含Brdu的培养基，在37℃的CO2培养箱中培养2h；2.集组织和细胞，用PBS清洗后，70％乙醇固定，常规石蜡包埋切片；c.切片脱蜡水化，3％H202阻断内源性过氧化物酶20min，蒸馏水洗；d.0.1NNaCl于4℃处理5min，再用90％的甲酰胺水溶液58℃孵育30min，以变性DNA；e.4℃预冷的PBS清洗2min，以停止DNA变性；f.利用抗Brdu抗体，按免疫组织化学方法染色；g.苏木素衬染；h.计数2000～5000个细胞，计算阳性细胞的百分率，求得标记(biāojì)指数LI。第五十三页，共七十四页。精选ppt应用1982年，Gratzner等首先利用抗5-Brdu和抗5一碘脱氧尿啼啶核苷单克隆抗体显示DNA复制，与用3H-TdR标记法所获结果一致。随后该方法得到广泛应用，获得满意结果，认为此法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量。

存在的问题Brdu标记技术虽然不用(bùyòng)放射性同位素，但仍需要新鲜组织；组织或细胞的离体时间、Brdu浓度是影响结果的重要参数。离体时间超过15min将严重影响结果的可靠性。第五十四页，共七十四页。精选ppt3.细胞核仁组成区嗜银相关蛋白（AgNOR)概述：核仁组成区（Nucleolusorganizerregion,NORs)位于核仁rDNA袢，由rDNA、rRNA组蛋白、非组蛋白等组成。参与蛋白质、核糖体合成及核仁组成。NORs的酸性非组蛋白又称为核仁组成区相关蛋白，能与Ag结合(jiéhé)并被还原为氧化银沉淀，故称为核仁组成区嗜银相关蛋白（AgNOR)。常用明胶液和硝酸银等作为染色剂。可用在石蜡切片或细胞涂片中，应用广泛。是常用的检测细胞增殖活性方法。第五十五页，共七十四页。精选ppt细胞核内AgNOR数目反映：核仁内rDNA的转录活性水平；在染色体组中NOR染色体的数目，及细胞分裂周期中所处的阶段。组织切片中AgNOR平均计数(jìshù)增加的原因：（1）细胞增殖活跃，以致细胞核内核仁分解，AgNOR分散于细胞核中（2）核仁融合缺陷，使AgNOR分散（3）细胞的染色体倍体数增加（4）rDNA转录活性增加第五十六页，共七十四页。精选ppt染色方法NORs的染色方法很多，有银染一步法、火棉薄膜覆盖法、PEG法、双重染色法和铋染法等，应用最广的还是银染一步法。HoweU银染一步法1．切片的制备手术切除的肿瘤标本，lO％甲醛溶液(福尔马林)固定，常规石蜡包埋，作连续4gm切片。2．胶质银工作液配制将明胶溶于1％甲酸液使其成为2％溶液(即2克明胶溶于100ml1％甲酸液中)，将此液按1：2容积比与50％硝酸银混合即成。3．染色(1)切片常规脱蜡至去离子水水化。(2)暗室内(shìnèi)，室温(20~25C)下滴加胶质银工作液覆盖切片表面，一般以27—60分钟为宜。(3)流水充分冲洗切片(4)对比染色(中性红苏木素或甲基绿等)。(5)常规脱水透明封片4．结果切片背景为浅黄色，AgNOR颗粒为深棕色。第五十七页，共七十四页。精选ppt固定剂的选择由于AgNOR技术在组织病理学上的应用日益广泛，Smith等(1988)及时(jíshí)研究了一系列固定剂对AgNOR的影响。他们发现乙醇类固定剂效果最佳，10％甲醛溶液固定剂效果是满意的，10％中性甲醛溶液的效果接近于乙醇类固定剂。一般说来，可选用的固定液为：乙醇、丙酮、10％甲醛溶液、10％中性甲醛溶液，Carnoy’s固定液、Clark’s固定液。不应选用的固定液为：升汞甲醛溶液、Helly’S固定液、Zenker’s固定液、戊二醛／苦味酸固定液。第五十八页，共七十四页。精选pptAgNOR的形态分型:1.单一型为境界清楚边缘光滑的圆形颗粒,颗粒周围常有一空晕.颗粒位于核中央或偏位,此型在良性病变中多见2．弥散型在核浆内散在分布、大小不一的颗粒。数目一般可多达10～20个，甚至更多。颗粒形态可为圆点状、条块状或不规则形，有时亦可见相互重叠的现象(xiànxiàng)。此型在恶性肿瘤中多见。3．聚集型耷核浆内散在分布大小不一的颗粒，颗粒常聚集成团块状、条索状或不规则形，无法明确计数。4．核仁内型胞核内有一个或数个核仁，核仁大小不一，大者直径可达2．5～6扯m，核仁周边常有空晕。每个核仁内有境界清晰或不清晰的颗粒，数量不等。5．混合型上述各型均可相互混合，混合所占的比例大致相同。

第五十九页，共七十四页。精选ppt计数方法:为了便于与修改后的标准化方案比较，1993年的“上海方案”的计数原则如下：，1．每例涂片至少计数50个细胞，切片至少计数100个细胞。计数细胞内每一个可辨别的颗粒。2．直径≥2．5μm的团块或颗粒按5个颗粒计算(jìsuàn)。3．最后按单位细胞核内的．AgNOR数计算。4．除计数外，尚须注明形态分型。AgNOR颗粒形态的观察与计数同样重要，特别是病变介于良恶性之间或细胞增生活跃者更应注意颗粒形态类型。第六十页，共七十四页。精选pptFigure1.Silver-stainedHodgkin'sandReed-SternbergcellsinlymphnodeimprintsfromapatientwithHodgkin'sdisease(originalmagnificationx1000).

第六十一页，共七十四页。精选pptFig3A-B.Highpowerfieldofsilverstainedpreparationof(A)parostealand