免疫原和抗血清的制备-课件

第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备

免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与抗体或致敏淋巴细胞发生反应的物质颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸抗原的制备对免疫学技术的意义：制作诊断试剂的需要制备抗体的需要精品资料你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”免疫原的制备流程选材预处理细胞粉碎提取纯化

鉴定冷藏保存细胞抗原：绵羊红细胞细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原寄生虫体抗原：虫卵一、颗粒性抗原的制备1.绵羊红细胞：配成2％～5％的细胞悬液。2.细菌免疫原：鞭毛抗原需甲醛处理；菌体抗原应加温去除鞭毛抗原（100℃

加热2-2.5小时）。3.虫卵：制备成悬液（一）可溶性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化

可溶性抗原包括蛋白质、脂多糖、核酸等，多来源于人和动物的组织或细胞，需先将组织或细胞破碎，再提取和纯化，才能获得所需的可溶性抗原（体液、组织液中抗原直接提取）。组织抗原的制备细胞的破碎⑴酶处理法：溶菌酶溶解G-菌的细胞壁；纤维素酶能溶解真菌的细胞壁。作用条件温和，不易破坏内含物的成分，条件可控。⑵反复冻融法（快冻慢溶）：冷冻使细胞内水分形成冰晶或剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，适用于组织细胞破碎，对微生物作用差。⑶超声波破碎法：作用较温和，对大多数组织细胞破碎效果好，重复性好，节省时间。对细菌和厚膜孢子效果差。⑷表面活性剂处理法：通过改变膜的通透性和渗透压，多用于细菌破碎和提取核酸。超速离心法：根据抗原比重特点进行分离差速离心法－低速和高速离心交替进行适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原（IgM(800kD)、C1q(410kD)),小分子抗原（载脂蛋白A28.3kD)特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。密度梯度离心法－区带离心法离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率（二）可溶性抗原的纯化选择性沉淀法：根据蛋白质理化特性差异核酸去除法：氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素盐析法：高浓度盐离子在蛋白质溶液中与蛋白质竞争水分子，破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质从液体中沉淀出来。不同蛋白质在不同盐浓度中有不同的溶解度，33%-50%硫酸铵特点：方法简单、有效，不影响抗原活性；盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化有机溶剂沉淀法：降低溶液的电解常数，增加蛋白质的静电引力，是蛋白质溶解度降低，蛋白质聚集而沉淀。特点：分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制聚合物沉淀法：聚乙二醇，能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀,蛋白分子量越大需要的PEG浓度越低,PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定比浊法和循环免疫复合物测定法。凝胶层析法：利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离

层析法：离子交换层析法：

利用蛋白质带电荷不同进行分离

离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂

离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂

阳离子交换剂—

带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂—

带正电荷，与阴离子交换增加离子强度（增加介导常数）或减少pH(减少蛋白质电荷），使蛋白质从离子交换剂上解吸附亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力

抗原—抗体受体—配体电泳法：

利用分子量和电荷量不同进行分离

（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA三、人工抗原的制备

半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质人工结合抗原、人工合成抗原和基因工程抗原人工结合抗原①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白牛甲状腺球蛋白血蓝蛋白②多肽聚合物：多聚赖氨酸（polylysine）③大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose,CMC)

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）

（一）载体①物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原吸附的载体有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等

（二）半抗原与载体的连接方法②化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法戊二醛法混和酸酐法过碘酸氧化法不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接

半抗原-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-载体（三）半抗原性免疫原的鉴定

一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子，才能有效的刺激产生免疫应答半抗原与载体的比例测定：吸收光谱分析法放射性核素标记半抗原渗入法第二节免疫佐剂免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。

化合物（本身不具有免疫原性）:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂质体生物制剂（本身具有免疫原性）:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、polyI∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)

一、佐剂的种类弗氏佐剂(Freund,sadjuvant)：弗氏不完全佐剂－羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏完全佐剂－弗氏完全佐剂加卡介苗乳化方法：研磨法和搅拌混合法

改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。

改变抗体的产生类型及诱导迟发超敏反应二、佐剂的作用机制第三节抗血清的制备

抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体一、免疫动物的选择我要制备抗人HSP70抗体，我不能选择什么样动物？我要制备抗鸡IgG抗体，我不能选择什么样动物？抗原来源与动物种属关系远的动物个体必须适龄、健康、体重合适抗原的性质：蛋白质抗原对大部分抗原皆适用，常用羊、兔有些物质动物体内有类似物质或者蛋白抗原对这些动物免疫原性差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶对山羊，免疫后不出现抗体。抗血清用量和要求：R型血清（家兔）：抗原抗体反应比例合适范围宽,适用于诊断。H型血清（马）：抗原抗体反应比例合适范围窄，适用于免疫治疗。一、免疫动物的选择免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、免疫动物种的个体状态、免疫时间决定。

中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体

高特异性抗体：低剂量短程免疫高效价抗体：高剂量长程免疫免疫间隔时间

第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天免疫途径

皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结

颗粒性抗原选择静脉免疫二、免疫方法颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊

心脏采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、鸡

静脉采血法：

家兔、山羊、绵羊

三、动物采血法第四节抗血清的鉴定和保存抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验、双向免疫扩散试验、ELISA抗体纯度的鉴定：SDS、双向免疫扩散试验、免疫电泳抗体亲和性的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验

一、抗血清的鉴定

抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示(表示1mol抗体稀释至多少升，才能使抗原-抗体结合下降50%。单位为稀度单位（LM-1）

Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度第五节抗血清的纯化

抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。盐析法：硫酸铵盐析法提取γ球蛋白离子交换层析法：QAE-sephadex带正电荷，IgG带