AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

作者：徐家云，刘章锁,马沙，娄丹，王宜娟，卢丹萍

【摘要】目的探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及二代腹膜间皮细胞经黄芪注射液(AGI)预处理后的干预作用。方法体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至2代，静止24h后，随机分为：正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)。用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚基p47phox的表达。Western印迹检测p47phox的蛋白表达。结果①AngⅡ可显着增加大鼠腹膜间皮细胞ROS产生，刺激20min后，ROS的表达较对照组显着上升()。AGI可显着抑制AngⅡ刺激后ROS的产生,且AGI对ROS的抑制程度与AGI的浓度呈正相关，B组、C组、D组三组比较后差异显着();②大鼠腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激后，NADPH氧化酶亚基p47phoxmRNA和蛋白的表达均上升，AGI可抑制AngⅡ诱导的p47phoxmRNA的表达上调，C、D两组分别与B组比较后差异显着()。结论AngⅡ可诱导大鼠腹膜间皮细胞产生的ROS增加、NADPH氧化酶亚基p47phox表达上调;AGI可抑制NADPH氧化酶的表达和活性及ROS的产生，从而为AGI防治腹膜纤维化提供了理论依据。

【关键词】腹膜间皮细胞;血管紧张素Ⅱ;活性氧;NADPH氧化酶;黄芪

ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectsofangiotensinⅡonthereactiveoxygenspeciesofperitoneummesothelialcellsandexpressionofnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(NADPH)oxidasesubunitp47phoxaswellastheroleofastragalusinjection(AGI)interventionforsecond-generationperitoneummesothelialratperitoneummesothelialcellswereculturedintothesecondgenerationinvitro.Aftersynchronizationfor24hours,thecellswererandomlyassignedtocontrolgroup(GroupA),AngⅡ(10-7mol/L)group(GroupB),AngⅡ+AGI(2g/mL)group(GroupC),andAngⅡ+AGI(1g/mL)group(GroupD).TheDCF-sensitivecellularROSwasmeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.RT-PCRwasemployedtodetectthemRNAexpressionofNADPHoxidasesubunitp47phox,andp47phoxproteinexpressionwasexaminedbyWestern①AngⅡsignificantlyinducedtheproductionofintracellularROScomparedwithcontrol().Afterstimulationfor20minutes,ROSexpressionincreasedsignificantlycomparedwiththatincontrolgroup().AGIinhibitedAngⅡ-inducedROSgeneration,andtheinhibitoryeffectwaspositivelycorrelatedwithitsconcentration.GroupsB,CandDdifferedsignificantlyfromeachother().②AngⅡstimulatedNADPHoxidasesubunitp47phoxmRNAandproteinoverexpressions,andAGIinhibitedtheup-regulationofp47phoxmRNAoverexpression.GroupsCandDwerecomparedwithGroupB,respectively().ConclusionAngⅡcansignificantlyinducetheproductionofratperitoneummesothelialintracellularROSandup-overexpressionofNADPHoxidaseandcellularROSgeneration,whichprovidestheoreticalbasisforAGIspreventionofperitonealWORES:peritoneummesothelialcell;angiotensinⅡ;reactionoxygenspecies;nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(NADPH)oxidase;astragalus

腹膜纤维化是长期腹膜透析(peritoneumdialysis,PD)患者的重要并发症之一，最终导致腹膜结构异常、丧失超滤功能而退出腹膜透析。高糖腹膜透析液可引起腹膜发生氧化应激反应，导致腹膜结构和功能异常。近年研究证实，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)参与了腹膜间皮细胞的转分化和细胞外基质的积聚，与腹膜纤维化的发生发展密切相关[1-2];烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶作为活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的调控酶，其胞浆亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着枢纽性作用[3-4]。调节NADPH氧化酶亚基p47phox的表达及活性成为改善氧化应激状态、防治腹膜纤维化的重要切入点。色谱指纹图谱证实黄芪注射液有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰，超微结构证实黄芪注射液能拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤[6-7]。为此，本研究应用黄芪注射液来观察AngⅡ对腹膜间皮细胞的影响，以探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox等表达的影响、及黄芪的干预作用，为腹膜纤维化防治提供新的思路。

1材料与方法1主要试剂胎牛血清(FBS)、DMEM/F12干粉培养基(GIBCO公司);胰蛋白酶(Amerasco公司);AngiotensinⅡ(Sigma,USA);黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司生产，国药准字Z33020179，每支10mL相当于原材料20g);H2-DCFDA(MolecularProbes,USA);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(Fermentas公司);RNase抑制剂(GIBCOBRL公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，博彩公司);DNAMarker(DL2000，TaKaRa公司);琼脂糖(Biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗体(Upstate公司，USA);兔抗大鼠GAPDH抗体(Dako公司，Denmark);BCA法蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司);TEMED(Sigma公司)，其余化学试剂为国产分析纯。2大鼠腹膜间皮细胞的分离与培养健康清洁级雄性SD大鼠，体重180～220g，由河南科技大学机能实验中心提供，每只肌肉注射100mL/L水合氯醛约～。待麻醉后向大鼠腹腔内注射20～30mL/L胰蛋白酶+/LEDTA消化液。2h后断颈处死大鼠，750mL/L酒精全身浸泡消毒5min。将大鼠仰面放置于超净工作台上，沿腹白线依次剪开腹壁皮肤及肌肉，吸出腹腔内液体，移入15mL离心管中。1500r/min离心15min，弃上清，加入含100mL/LFBS的DMEM/F12培养液，轻轻用吸管吹打使之成为细胞混悬液，分装于25cm2的细胞培养瓶中。再加入培养基使之总体积达到4～5mL，放入条件为37℃、950mL/L空气、50mL/LCO2的细胞培养箱中培养。每3d更换一次培养基。免疫组织化学方法鉴定结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性，将2代腹膜细胞随机分为以下4组：正常对照组，AngⅡ(10-7mol/L)刺激组，两组用无血清的DMEM/F12培养基培养;黄芪注射液高浓度(2g/mL)干预组，黄芪注射液低浓度(1g/mL)干预组，两组提前孵育1h进行干预处理。在合适的时间点，观察以上各组各指标的变化情况。3细胞内ROS的测定ROS的测定按文献报道方法。具体将细胞传至激光共聚焦专用培养皿(Corning公司)，静止24h同步化后，KRH缓冲液清洗3次，将各组细胞用10mg/LH2-DCFDA避光孵育37℃15min，KRH缓冲液再清洗3次，激光共聚焦显微镜观察，激发波长488nm，发散波长505nm，摄像。测定各组荧光强度值，并以对照组荧光强度为基线，计算其他各实验组相对荧光强度值。4实时定量RT-PCR检测总RNA提取按照Trizol试剂说明书操作。取2μg总RNA按反转录试剂盒说明书合成cDNA。用实时定量PCR仪(美国MJResearch)检测mRNA的表达。定量PCR反应体系：SYBRGreenMixμL，引物各μL，cDNAμL，加三蒸水补足至15μL。反应条件：94℃预变性5min，92℃变性15s，60℃退火并延伸1min，共40循环，72℃终末延伸10min。PCR产物于12g/L琼脂糖凝胶电泳FluorechemTM8900凝胶成像系统成像，以目的基因与内参照GAPDH积分吸光度的比值作为定量值进行统计分析。引物序列见表1。表1实时定量PCR的引物序列forRTQ-PCR基因引物序列产物长度5Western印迹

按文献报道方法[11]。取各组细胞，PBS洗2遍，加入细胞裂解液，收获蛋白质，4℃，12000r/min，离心15min，Bradford法测定浓度。取适量的蛋白质标本，100g/L丙烯酰胺(SDS)凝胶上电泳，电压90V30min，140V60min。室温恒压100V维持90min。丽春红染色硝酸素纤维膜，观察蛋白转移结果。TBST洗膜：室温下10min。50g/L脱脂奶粉阻断：室温下轻摇60min。TBST洗膜：室温下10min×3次。抗原抗体免疫反应加入TBST稀释的p47phox(1∶500)或GAPDH(1∶1000)抗体孵育：4℃摇床轻摇过夜。TBST洗膜：室温下10min×3次。分别与辣根过氧化物共轭的抗-兔的Ⅱ抗(1∶1000)及HRP-anti-biotin抗体(1∶1000)室温下孵育1h。TBST洗膜：室温下10min×3次。显影、检测ECL发光。室温下将膜浸于发光剂中1min后，取出膜甩去多余液体，将硝酸素纤维膜置于两张干净的保鲜膜之间，在暗室中对着X-线胶片曝光～30min不等。胶片投入自动洗片机中冲洗和烤干。于凝胶成像系统进行目的蛋白及内参照GAPDH条带灰度分析。6统计学处理应用统计软件进行分析。吸光度分析采用单位面积计算机图像扫描值减去背景值的均值表示信号强度，以GAPDH作为内参照，计算两者吸光度的比值，并以对照组或0h组作为基准，计算其他各实验组相对吸光度值，以±s表示。组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。为差异有统计学意义。

2结果

大鼠腹膜间皮细胞的鉴定培养的大鼠腹膜间皮细胞呈菱形、椭圆形、多边形等，细胞融合后，呈典型的铺路石样。免疫组化结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性。在AngⅡ10-7mol/L浓度作用12h后，RPMCs失去原来的整齐排列，细胞间隙增宽，但细胞形态未出现明显的改变(图1)。图1腹膜间皮细胞的形态Morphologyofperitonealmesothelialcells(×200)A：正常大鼠腹膜间皮细胞的形态;B：血管紧张素Ⅱ刺激后大鼠腹膜间皮细胞的形态。

Ⅱ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用激光共聚焦显微镜观察DCF荧光强度代表ROS产生的量。正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)，在DCF孵育20min后，ROS的产生情况如图所示(图2)。统计学分析，腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激20min后，ROS产生较A组显着增加()。C组、D组均可显着逆转由AngⅡ刺激诱导的ROS产生增加，与B组比较，均差异显着()。C组与D组相比较差异显着()，说明ROS产生的量与AGI的浓度呈负相关(图3)。图2激光共聚焦显微镜DCF荧光DCFfluorescentmodelunderlaserconfocalmicroscopeA：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)。图3AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用AngiotensinⅡinfluencedROSproductionandeffectofastragalusintervention(n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组。Avs.B，;Bvs.C，;Bvs.D，;Cvs.D,。

Ⅱ对NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用实时定量RT-PCR结果显示，AngⅡ可诱导NADPH氧化酶亚基p47phoxmRNA表达上调，且以时间依赖模式上调，p47phoxmRNA从4h开始有统计学差异()，至12h到达峰值(图4)。Westernblot结果显示，AngⅡ可诱导p47phox蛋白表达以时间依赖模式上调，从12h开始有统计学差异()，至48h达峰(图5)。图4AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phoxmRNA的表达情况AngⅡinducedNADPHoxidasesubunitsp47phoxmRNAexpression(n=4)4、8、12、24hvs.0h，。图5AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白的表达情况AngⅡinducedNADPHoxidasesubunitsp47phoxproteinexpression(n=4)12、24、48、72hvs.0h，。PMCs经AGI预处理后，再行AngⅡ体外刺激，可显着逆转由AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phoxmRNA表达上调，C组、D组分别与B组比较，具有显着差异()，但未观察到C组与D组有显着性差异，AGI对p47phoxmRNA表达的抑制度不依赖浓度模式(图6)。图6AGI预处理可显着逆转AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phoxmRNA表达的上调AGIpretreatmentcouldreverseAngⅡ’sinductionofNADPHoxidasesubunitsp47phoxmRNAexpression(n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组;Avs.B，;Bvs.C，;Bvs.D，。

3讨论

腹膜纤维化是腹膜透析的重要并发症之一，对其发病机制的不断探讨、寻找新的治疗靶点及有效干预剂是腹膜透析进一步发展的迫切需要。AngⅡ不仅作为一种血管活性物质参与RAS的活化效应过程，而且局部产生的AngⅡ作为一种重要的生长因子参与调节细胞的增值、凋亡及纤维化进程，是引起腹膜纤维化的重要因子之一[10-12]。NADPH氧化酶是一种过氧化物酶,广泛存在于吞噬细胞及非吞噬细胞，其催化产物活性氧(reactlveoxygenspecies,ROS)参与机体防御和信息传递等许多生理过程。NADPH氧化酶主要由5个亚基组成，包括2个膜亚基：gp91phox、p22phox;3个胞浆亚基：p47phox、p40pox、p67phox。另外，还有2个低分子量的GTP结合蛋白Rap1A和rac2。当细胞受到相应刺激后,胞浆亚基p47phox被磷酸化激活，与p67phox结合并向胞膜转位，与胞膜亚基结合组成有氧化活性的复合体，将氧催化为-O2-，进而产生一系列活性氧，造成细胞损伤。NADPH氧化酶作为ROS的调控酶，其胞浆亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着始动、枢纽性作用[13-15]。如前所述，色谱指纹图谱证实黄芪注射液有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰，其拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤的作用已被证实。该实验研究中，在AngⅡ作用下，ROS的产生明显增加，腹膜间皮细胞NADPH氧化酶亚基p47phoxmRNA和蛋白结果一致，均呈时间依赖模式的表达上调。我们应用黄芪注射液预处理后发现，黄芪不仅可明显减少由AngⅡ诱导的腹膜间皮细胞ROS的产生，而且可使NADPH氧化酶亚基p47phox的表达降低。该实验表明黄芪不仅能够抑制NADPH氧化酶的表达，而且可抑制其活性。由此我们推测，黄芪通过抑制腹膜间皮细胞NADPH氧化酶的表达及其活性，从而减少腹膜间皮细胞ROS的产生，阻断ROS在其中的信号传导作用，及下游因子TGF-β的过度表达，减轻细胞的转分化和细胞外基质的积聚，增加细胞外基质的降解而发挥其延缓腹膜纤维化的作用。

综上所述，长期腹膜透析患者，腹膜间皮细胞暴露于腹透液高糖、低pH值、乳酸盐和葡萄糖降解物GDP等多种生物不相容因素下，可导致腹膜纤维化，AngⅡ、ROS、NADPH氧化酶均参与其中。腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激，其ROS产生明显增多。ROS产生增多与其调控酶——NADPH氧化酶的表达上调密切相关。黄芪注射液能够抑制NADPH氧化酶的表达，减少腹膜间皮细胞ROS的产生，从而减少腹膜的氧化应激损伤，延缓腹膜纤维化的发生发展。

【参考文献】

“[1“]KIRIBAYASHIK,MASAKIT,NAITOT,etal.AngiotensinⅡinducesfibronectinexpressioninhumanperitonealcellsviaERK1/2andP38MAPK“[J“].KidneyInt,2005,67:1126-1135.

“[2“]NOHH,LEEHB,YUMR,etal.AngiotensinIImediateshighglucose-inducedTGF-beta1andfibronectinupregulationinHPMCthroughreactiveoxygenspecies“[J“].PeritDialInt,2005,25(1):38-47.

“[3“]KARENB,KARL-HEINZK.TheNOXfamilyofROS-generatingNADPHoxidases:physiologyandpathophysiology“[J“].PhysiolRev,2007,87:245-313.

“[4“]HAH,CHAMK,CHOIHN,etal.Effectsofperitonealdialysissolutionsonthesecretionofgrowthfactorsandextracellularmatrixproteinsbyhumanperitonealmesothelialcells“[J“].PeritDialInt,2002,22(2):171-177.

“[5“]张磊，聂磊，王唯红.黄芪注射液色谱指纹图谱与抗氧化作用的相关分析“[J“].中药材，2009,32(11):1757-1760.

“[6“]舒静，王怡，张晓云.黄芪注射液拮抗高糖腹膜透析液对腹膜间皮细胞紧密连接的影响“[J“].上海中医药大学学报,2007,21(4):50-53.

“[7“]徐家云，王俊霞，孟晓青，等.黄芪注射液对大鼠腹膜透析效能及腹膜超微结构的影响“[J“].河南科技大学学报,2006,24(2):81-83.

“[8“]YANGX,YER,KONGQ,etal.CD40isexpressedonratperitonealmesothelialcellsandupregulatesICAM-1production“[J“].NephrolDialTransplant,2004,19(6):1378-1384.

“[9“]ZHANGZ,YUANW,SUNL.1,25-DihydroxyvitaminD3targetingofNF-κBsuppresseshighglucose-inducedMCP-1expressioninmesangialcells“[J“].CultRev,2007,72(2):193-201.

“[10“]RHYUDY,YANGYQ,HAH,etal.RoleofreactiveoxygenspeciesinTGF-β-inducedmitogen-activatedproteinkinaseactivationandepithelial-me