实时荧光定量PCR的原理和应用课件

实时荧光定量PCR的原理和应用目录• 实时荧光定量PCR原理PCR荧光标记绝对定量和相对定量• 实时荧光定量PCR应用• 实时荧光定量PCR发展digitalPCR,qPCR

Array实时荧光定量PCR原理聚合酶链式反应Polymerase

chain

reaction

(PCR)1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。聚合酶链式反应Polymerase

chain

reaction

(PCR)PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链结合引物子链延长PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链结合引物子链延长GGAUCG

5‘5‘

AUCGCG3’3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5‘3’DNA解旋解链结合引物子链延长TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCG5‘AUCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR原理1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA单链与引物复性DNA双螺旋DNA2变性形成条单链子链延伸DNA加倍模板DNA第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增第四轮扩增第五轮扩增实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个

循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。荧光PCR特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过程，无需后处理即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)

valueCt值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0

(1+Ex)n• n：扩增反应的循环次数• X：第n次循环后的产物量• X0：初始模板量• Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理-定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct

=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX0

(1+Ex)Ct整理方程式(2)得:(2)lg

X0=

-

Ct×

lg(1+Ex)

+

lg

M (3)Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-定量原理

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。

Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。40393837363534333231302928272625242322212019181716151101001000

10000Copy

Numbers100000100000010000000C(t)

ValueStandard

Curve实时荧光定量PCR原理-相对定量XCt=X0(1+Ex)Ct,x=KxRCt=R0(1+ER)Ct,R

=KRXCtRCt

R0(1+ER)Ct,RX0(1+Ex)Ct,xK=

x

=

KKR=X0R0×

(1+E)Ct,x-Ct,R=

KXN

×

(1+E)

Ct

=

KXN= RX00Ex=ER=E:XN

=

K×(1+E)

-CtXN,q

=

K×(1+E)

-Ct,qK×(1+E)

-Ct,cb

=XN,cb(1+E)

-

Ct

Ct=

Ct,q-

Ct,cb样本q的XN除以校准样本（Calibrator）cb的XN：靶核酸：参比内标：Ct=Ct,x-Ct,R：实时荧光定量PCR原理-相对定量Livak&

Schmittgen,

Method,2001,25:402-408绝对定量和相对定量• 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）– 病毒DNA或RNA的拷贝数– 转基因的拷贝数• 相对定量：计算初始反应模板的相对含量– 差异表达分析– 芯片评估– 转基因生物的检测– 基因型检测荧光标记非特异性荧光标记：1、

SYBRGreen

Ⅰ2、EvaGreen3、LC Green特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、AmplisensorRQ QSYBR

GREEN

ISYBRGreenⅠ 能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen

SYBRGreen

Ⅰ 只有和双链DNA结合后才发荧光

变性时，DNA双链分开，无荧光

复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreenⅠ发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR

GREEN

熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSYBR

GREEN

熔解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物SYBR

GREEN法优缺点

对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA

使用方便-----不必设计复杂探针

非常灵敏

便宜优 点 缺 点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分

析，优化反应条件

对引物特异性要求较高FRET当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。Taq

man探针与目标序列互补

5′端标记有报告基团(Reporter,

R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团

(Quencher,

Q)

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收

，无荧光，

R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）

Taq酶有

5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taq

man

探针•

特异性荧光双标记探针Taq酶

5’→3’外切酶活性Taq

man

探针法优缺点

对目标序列的高特异性------阴性结果确定

设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优

点

只适合一个特定的目标

委托公司标记，价格较高

不易找到本底低的探针缺

点Molecular

Beacon

分子信标环标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成茎荧光素 淬灭剂Molecular

Beacon

分子信标Molecular

Beacon

分子信标高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优

点 缺

点

只能用于一个特定目标

设计困难

价格比较高高分辨率熔解曲线High

resolution

melting

cure(HRM)Reed

et

al.

Pharmacogenomics

(2007)

8(6),

597–608实时荧光定量PCR应用实时荧光定量PCR应用基因扩增扩增特异性分析基因定量分析基因检测基因分型SNP分析RFLP多态性分析单/多基因表达研究高通量基因表达谱研究疾病的早期诊断•

免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。•

病原体检测：确定病原体的种类和基因型，以利于治疗方案的确定遗传疾病的早期诊断• 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测，对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。药物研究•

任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。•

新药筛选：药物作用靶标的研究，基因表达的变化•