基因工程基本操作程序

关于基因工程基本操作程序第1页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三一、目的基因的获取

1.基因的结构2.目的基因的概念3.目的基因的获取的方法第2页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三1.基因的结构（1）原核生物基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质调控遗传信息的表达（调控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…启动子终止子第3页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三编码区非编码区非编码区启动子终止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.

终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。第4页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子（2）真核与原核生物基因结构的比较外显子内含子编码蛋白质（不能编码蛋白质）①相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。②不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。真核生物基因结构第5页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三外显子：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。第6页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三2.目的基因的概念

主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。第7页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三3.目的基因的获取的方法（3）用化学方法直接人工合成目的基因（1）从基因库中获取目的基因（2）应用PCR技术扩增目的基因第8页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三（1）从基因库中获取目的基因①基因文库和部分基因文库的慨念②基因组文库和cDNA文库的主要区别③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因第9页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三①基因文库和部分基因文库的慨念：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。

基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。第10页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三部分基因文库的建立方法mRNA反转录酶单链DNA合成

双链DNA（cDNA）

载体插入导入受体菌群（cDNA文库）分离目的基因基因组文库的建立方法提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与运载体连接导入受体菌中储存（基因组文库）分离目的基因第11页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三cDNA合成过程

第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的

DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。29.06.202312第12页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三②基因组文库和cDNA文库的主要区别

文库类型cDNA文库

基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

基因多少

物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第13页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三（2）应用PCR技术扩增目的基因①定义：②原理：DNA双链复制PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因DNA分子热变性（在90～95OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之处)③仪器：PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）④条件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，三磷酸脱氧核苷酸dNTP，酶等。第14页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三④过程：a.DNA热变性（90～95OC)：b.复性或退火（55～60OC)：c.延伸（70～75OC)：d.重复a.b.c步骤：

双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNA系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNA

在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNA

每重复一次，目的基因增加一倍PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。第15页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因

根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。第16页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤

一、待测核酸样品的制备

（一）制备待测DNA

将基因文库中的所有菌落裂解，用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA（如量不够可用PCR扩增）（二）DNA限制酶消化

基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。消化后电泳分离DNA（三）DNA变性：分离后移至于碱性溶液中浸泡，DNA片段经过碱变性作用，形成单链状态。单链DNA片段转移到固相（一种特制的膜）支持物上。第17页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤二、探针标记：通过PCR方法将目的基因已知的部分核酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记，即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性成单链。三、Southern杂交：将待测单链DNA滤膜和标记的探针单链DNA放入杂交液中即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。第18页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤四、放射性自显影检测

将杂交后的滤膜，放入有2张X光底片暗盒中，使滤膜对X光底片曝光然后冲洗X光底片，在膜上阳性反应（杂交带）。主要应用

1.遗传病诊断2.DNA图谱分析3.PCR产物分析第19页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三(3)用化学方法直接人工合成目的基因蛋白质氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→目的基因序列→目的基因针对：基因比较小，核苷酸序列又已知推测化学合成思考：

不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？推测第20页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三1.作用：二.基因表达载体的构建——核心IMN2.组成：①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。②同时使目的基因能表达和发挥作用。(3)终止子：是使转录在需要的地方停止(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来(2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位(1)目的基因

不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。第21页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种基因表达载体的构建29.06.202322第22页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三寻根问底：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。第23页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三资料:

科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。

然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。

资料证明：载体构建组成要完整第24页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三三、将目的基因导入受体细胞1.转化：

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程2.常见转化方法：①农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。（1）将目的基因导入植物细胞③基因枪法：单子叶植物。

②花粉管通道法（3）将目的基因导入微生物细胞—感受态细胞法。（2）将目的基因导入动物细胞——显微注射法。第25页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三①特点:

农杆菌转化法：（1）将目的基因导入植物细胞能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力②过程：③适用生物：双子叶植物、祼子植物。第26页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNATi质粒苏云金杆菌构建表达载体Bt毒素蛋白基因

苏云金杆菌DNA连接酶

T-DNA(可转移-DNA)

知识拓展农杆菌转化法的过程：第27页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：②特点：

在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞十分简便经济③例：转基因抗虫棉第28页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三基因枪法：

利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法①操作方法：②金属粒：将目的基因导入单子叶植物细胞

钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物第29页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三①细胞类型：②操作程序：___显微注射法：（2）将目的基因导入动物细胞发育成新性状动物移植到子宫或输卵管培养成早期胚胎显微注射取受精卵（体内或体外受精）提纯含目的基因表达载体受精卵第30页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三③常用法：②常用菌：①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少④过程：大肠杆菌Ca2+处理获得感受态细胞Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA___感受态细胞法（3）将目的基因导入微生物细胞第31页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三例：第32页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三

若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗？答：不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器。以酵母菌作为工程菌可以吗?答：可以，酵母菌为真核生物（真菌类）。第33页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三四目的基因的检测与鉴定——检查是否成功

导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组

DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。

目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测1.检测方法：分子杂交技术：（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交2.个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病结种实验，活性比较实验第34页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三1.检测转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法：DNA分子杂交技术变性变性第35页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三

如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。第36页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三变性方法：DNA分子杂交（northern杂交）（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。第37页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样第38页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。2.鉴定——个体生物学水平的鉴定（1）多细胞个体抗虫、抗病接种实验，活性比较实验第39页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三

不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。

受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。第40页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。（2）单细胞生物无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物第41页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶课堂练习第42页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥课堂练习第43页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三3、有关基因工程的叙述正确的是（）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为运载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料第44页，讲稿共52页，2023年5月2日，星期三4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是

（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与运载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达1A2D3D4C第45页，