分子细胞遗传学技术与产前诊断

关于分子细胞遗传学技术与产前诊断第1页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三基因诊断的中心问题是认识遗传变异、基因突变及与表型之间的关系第2页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三一、分子细胞遗传学技术第3页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三荧光原位杂交技术（fluorescenceinsitehybridization,FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500kb.第4页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsitehybridization,FISH）的特异性DNA探针基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努力，越来越多的这方面探针可以使用着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素，在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。第5页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三应用15号染色体一基因特异性探针（红色）杂交确定其是否缺失；绿色探针鉴定15号染色体着丝粒。24种不同染色体涂染探针杂交得到的彩色染色体第6页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三染色体技术的应用－1inv(14)(p12q24)t(2;11)(2q34;11q13)第7页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三细胞遗传学研究中染色体技术的应用—FISH技术检出t(2;14)第8页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三染色体技术的应用－2inv(9)(p12q13)第9页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失第10页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三细胞遗传学研究中染色体技术的应用9号染色体涂染探针杂交。箭头示易位到10号染色体上的来自9号染色体的片段21号染色体涂染探针FISH杂交，显示21三体第11页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH）近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA，然后与正常人中期细胞染色体杂交。通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。第12页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三比较基因组杂交的原理第13页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三待测DNA（肿瘤细胞DNA，testDNA)为绿色参照DNA(正常细胞DNA，referenceDNA）为红色复染为蓝色人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交第14页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三中期染色体的DAPI的复染图B.中期染色体比较基因组杂交（CGH）：红色区域表示丢失，绿色区域表示扩增。第15页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三CGH的优点：经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和定位。无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体瘤尤为适用。所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检测，利于做回顾性研究。第16页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三CGH的局限性：难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基因重排，倍体水平改变。结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在，肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10—30MB）第17页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三二、突变分析与分子诊断第18页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（一）基因突变类型点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最多见的形式。稳定突变：传递中不改变原有的突变。动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生明显变化。

第19页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三点突变的结果：（1）同义突变（samesensemutation）：碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变。（2）错义突变（missensemutation）：碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸。（3）无义突变（nonsensemutation）：碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。（4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变蛋白质功能的“错义突变”第20页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三基因突变形式—碱基的插入和缺失碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（frameshiftmutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。第21页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变（frameshiftmutation），并可在突变点下游提前出现终止密码产生截短型蛋白缺失突变第22页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三基因突变形式框内突变（inframemutation）：3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸。DNA大片段缺失或复制（largedeletionorduplication)：几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。第23页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三各种类型病理性突变的比例无义突变和移码突变：60％稀有的错义突变：20％DNA大片段缺失或重复:20％另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点微小突变第24页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（二）目前常用的对已知点突变的分析技术限制性片段长度多态性（RFLP）等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）等位基因特异性寡核苷酸杂交（

ASO）DNA芯片第25页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析当突变影响到某一限制性内切酶位点时，可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制性片段长度多态性（RFLP）第26页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，分析结果。第27页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（

ASO）设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的位点，一段与野生型链互补，一段与突变型链互补。杂交分析是否存在突变第28页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.基因芯片：SNP位点的检测第29页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三Microarray-basedmethodforgenotypingoffunctionalsinglenucleotidepolymorphismsusingdual-colorfluorescencehybridization.MutatRes.2004;548:97-105第30页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（三）目前常用的未知基因突变分析技术异源双链体形成分析（Heteroduplexanalysis,HA）单链构象多态性分析（Single-strandconformationanalysis,SSCP）变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）变性高效液相色谱分析（Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）第31页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三体外蛋白截短实验（Proteintruncationtest,PTT）定量多重PCR技术（QuantitativemultiplexPCR,QM-PCR）多重探针连接依赖性扩增技术（MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation,MLPA)DNA序列分析（DNAsequencing)第32页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三1.异源双链体形成分析（HA）由突变型和野生型DNA链形成的异源双链DNA在其错配处形成一个凸起，电泳时会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率，从而使两者得以分离。技术路线：PCR产物95C变性5分钟，37C复性10分钟。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（0.2%硝酸银染色）第33页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用不同DNA序列开始变性时对变性剂浓度的要求不同，在变性剂浓度梯度凝胶内电泳，野生型DNA和突变型DNA序列的差异所导致其变性点不同使两者的电泳迁移率出现差异第34页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三3.单链构象多态性分析（SSCP）单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移率的差异。技术路线：PCR产物95C变性5分钟，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液0.5TBE，电压70v,4C环境下电泳过夜（0.2%硝酸银染色）。第35页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三4.体外蛋白截短试验（PTT）从蛋白质水平检测基因的突变。其原理是碱基缺失和插入导致的移码突变、碱基替换出现的无义突变均可使基因提前出现终止密码，从而截短mRNA翻译的蛋白质。技术路线：血细胞RNAcDNART-PCR体外蛋白质合成电泳分析截短了的蛋白质相应基因片段的序列分析第36页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三上游引物5’端均连接T7启动子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG[35S]甲硫氨酸，T7体外转录/翻译体系（兔网织红细胞提取物），30℃孵育90min，完成体外蛋白质合成。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第37页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三5.变性高效液相色谱分析（DHPLC）1995年OefnerandUnderhill首次报道DHPLC技术。其原理是在接近DNA融解温度条件下进行离子对反相高效液相色谱分析。DHPLC分析突变的原理：在DNA部分变性的条件下，变异型和野生型DNA可形成同源双链和异源双链．根据其在层析柱上保留的时间可以分辨出变异性型DNA.第38页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三用离子对反相高效液相色谱检测DNA变异是基于同时存在同源双链和异源双链。异源双链的检出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度的选定与野生型DNA融解温度（Tm）有关。DHPLC与其它突变分析技术的比较:对单个核苷酸变异的检出率:SSCP技术,约75%；DHPLC,>90%.第39页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三DHPLC的优点：灵敏，准确；分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；容易实现自动化操作；适用于较大样本中基因突变的筛选。第40页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三DHPLC分析：（野生型）第41页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三DHPLC分析:突变型（单个碱基改变）第42页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三DHPLC分析:突变型（单个碱基改变）第43页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三6.定量多重PCR技术（QuantitativemultiplexPCR，Q-M-PCR）目前各实验室普遍采用的突变基因分析技术对基因微小突变的检测具有较高的敏感性，如对单个碱基改变的检出率可达90%以上。但对于较大的DNA缺失或DNA重复产生的突变，如以外显子为单位的DNA缺失，SSCP、DHPLC等均难以将其检出。有资料表明大片段DNA缺失可占基因突变的三分之一第44页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三定量多重PCR技术要点：涉及至少2个基因的多个外显子在一个反应管内同时进行PCR扩增，其中一个外显子作为参照外显子，其余作为检测外显子；控制PCR循环数，使PCR产物的增加处于对数增长曲线内；PCR产物于DNA测序仪电泳，其结果经GeneScan软件处理；第45页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三以检测外显子PCR产物与参照外显子PCR产物的比值计算模版DNA相对拷贝数，确定是否存在检测外显子的杂合性缺失；检出的缺失经其它方法（长片段PCR或缺失断裂点测序）确认。第46页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三7.MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation—MLPADenaturedgenomicDNAishybridizedwithamixtureofmorethan40probes.EachMLPAprobeconsistsoftwooligonucleotides,onesyntheticandoneM13-derived.Thetwopartofhybridizedprobesareligated.AllprobeligationproductsareamplifiedbyPCRusingonlyoneprimerpair.ElectrophoresisofPCRproductsonDNASequencerinGeneScanmodel.第47页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三三、遗传性疾病的诊断第48页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三遗传性疾病的诊断：（一）临症诊断（二）症状出现前的诊断（三）产前诊断第49页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三（一）临症诊断根据就诊患者的临床表现作出（初步）判断：疾病诊断，遗传方式（1）症状、体征（2）系谱分析部分遗传性疾病的诊断主要依赖于症状、体征对于同时存在散发病例和遗传性病例的复杂性疾病，如肿瘤，建立相应的临床可疑病例的判定标准根据不同的遗传性疾病，选择适当的实验室技术分析确诊：生化技术、细胞技术、分子技术多用于对先证者的诊断第50页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三Pedigreeofafamily第51页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三遗传性疾病基因诊断程序临床诊断和确定分析对象确定分析的目标基因以检测目标基因的结构确定分析的技术构成和分析过程：基因微小变异筛查：SSCP,DGGE,DHPLC,PTT,DNA测序分析基因大片段变异（缺失或重复）的分析检出变异的性质评估和患者家族的遗传咨询。

第52页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三DHPLC突变分析第53页，讲稿共62页，2023年5月2日，星期三体外蛋白截短试验

（PTT）—HNPCC遗传性突变第54页，讲稿共62页，2023年