荧光检测复习题参考答案

荧光检测复习题参考答案(总11页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----10荧光检测在医学试验中的应用–复习题第一章总论荧光的发生及根本检测原理何谓发光分子吸取辐射被激发后以光的形式释放，辐射跃迁而衰变回到电子基态→发光荧光与磷光的区分荧光：激发后马上发光，第一电子激发单重态辐射跃迁；延迟109～107 秒后。基态S0→单重态S1、S2跃迁→基态。磷光：延迟秒或更长103～10秒电子自旋未配对进入受激三重态，三重态→跃迁→基态完成良好荧光检测的有关条件1〕2〕选择足够强度的激发光源，荧光强度与入射光强度成正比If＝φfI0(1It/I0)；3〕选择适宜(QE)的放射波长检测器件；4〕掌握好样品制备与检测环境体系。荧光的种类依据激发方式。1〕2〕3〕生物荧光。1〕2〕3〕诱导荧光有哪几种荧光现象III发出很弱的荧光，对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去，依据荧光探针的荧光分析大分子。影响荧光强度〔If〕的因素1片时应避光。2〔1〕温度淬灭：加快震惊弛豫而丧失振动能量；增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。温度适宜或低温。〔2〕浓度淬灭：浓度大时发光分子在样品中分布不均，深部的分子吸取不到光子，量子产额反而小。生成二聚体或多聚体，转变吸取光谱，If〔3〕杂质淬灭：静态淬灭，杂质与荧光分子组成另一种化合物。环境净化。碰撞、转入三重态淬灭。3pHpH7Tmax1/2λ1λ2)也称带宽(Bandwidth),带宽窄则光色纯。其次章荧光成像检测光学显微镜区分率定义及简易计算公式影响光学显微镜区分率的主要因素影响区分率的因素为衍射效应：圆斑像AIRY斑，阻碍区分率。聚光镜与物镜孔径光阑的对应调整目的：产生与物镜相应的光束，使镜像的反差和焦深处于最正确状NANA调整。观看：与物镜NA全都(100%)，以得到较好的区分率；照像：NA60~80%,以得到较好的反差、焦深。光学显微镜的有效放大＝所用物镜NA值的500～1000倍荧光量子效率〔QE〕荧光量子效(产)率=放射量子数／吸取量子数医学试验中荧光检测常用的荧光检测传感器是哪两种1转换光学信号为电子信号光学传感器,2彩色CCD显微镜照相术的定义将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术CCD温度和灵敏度，CCD工作时，外表会产生热量，使得在芯片形成暗电流，暗流将增加噪音、降低信噪比、导致降低成像质量。CCD显示或照片倍率＝OBJ倍率×光学适配器倍率×显示或照片对角线长度／CCDCCD数字CCD优点：价低，使用简便，成像块，测得FI同LSCM，彩色复原好，图像近于镜下，光化淬灭损害小。Ratio测钙、使用TC板，适于标本：薄、层次简洁。缺点：厚标本图像质量差，无光切功能，整合功能配置价格不菲3D观测，集成荧光分析功能。缺点：本钱高〔专人、耗材〕，光化淬灭损害较大免疫荧光染色的目的将抗体标记上荧光素〔如FITC、TRITC〕，与细胞内相应抗原〔目标蛋白〕结合后，通过观看、检测具有特征性的荧光，定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白免疫荧光染色常用方法直接法、间接法和双标记法影响免疫荧光染色结果的主要因素有1〕荧光染料标记的抗体的浓度，2〕pH3〕溶剂举例说明自发荧光主要包括哪些动物中一般为黄素类和卟啉类，植物中为叶绿素简洁产生自发荧光。脂褐素的自发荧光，弹力蛋白和胶原UV激发下呈黄绿色荧光，培育死细胞很简洁产生自发荧光。免疫荧光染色前对细胞接种密度的要求细胞密度：依据试验目的调整细胞接种密度。对细胞个体进展形态学观看以及定位荧光信号：细胞密度稍稀疏。使细胞充分伸展，显示出其应有的形态和构造；但也要留意保证视野内有肯定数目的细胞，以便选取有代表性的细胞采图，要求细胞所占面积不低于视野20%。定量测定荧光强度〔观看某种蛋白的表达量〕：细胞密度应稍高。用于做大量细胞的统计定量，细胞至少要占到视野面积的80%；这时细胞要布满视野但相互之间还有空隙，细胞排列均匀，不聚堆拥挤，防止细胞间挤压变形，影响定量结果。到达通常所说的亚融合状态。荧光显微镜观看免疫荧光染色需要设置的比照及意义正确设置比照组〔格外必要〕：1.阳性比照：抗原阳性的样品与待测样品同时进展免疫荧光染色，比照样品呈阳性结果，用于检验免疫荧光染色全过程是否符合要求，包括孵育温度、时间，一抗、二抗是否有问题，分析可能缘由。假设阳性比照呈阴性，则说明试验过程有问题，需要对每个条件加以分析改进。2.阴性比照：抗原阴性的样品作比照，比照样品应呈阴性结果。包括空白比照〔PBS代替一抗〕和替代比照〔非免疫血清代替一抗〕，用于排解非特异性染色。假设阴性比照呈阳性表达，同样检测样品的结果也是不行信的。3.不染色细胞空白组：不经免疫荧光染色，直接上机观看，用于检测由于细胞本身或固定造成的细胞自发荧光。共聚焦扫描显微镜〔LCSM〕光学成像原理检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 高区分率的光学切片共聚焦扫描显微镜(LSCM)与传统荧光显微镜比较的优点三维重建，4〕客观记录荧光信息，5〕同时显示多种标记物定义：荧光漂白恢复(FRAP)：经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照耀后,荧光物质的光化学构造被破坏,荧光强度下降,但此处荧光强度会渐渐恢复,荧光强度和恢复的快慢和多少,代表四周分子集中的速率,或分子运动速度。定义：荧光共振能量转移(FRET)：受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的供给者叫供体荧光素，能量的承受者叫受体荧光素。第三章荧光光度检测荧光分光光度计的构造示意图光源→激发单色器→样品杯→放射单色器→检测器→电子放大及掌握→显示微孔板荧光检测在医学试验的应用1〕利用报告基因检测目标基因的表达：将报告基因引入细胞DNA使之与某一特定分子大事相关，可以为这一分子大事带来可测性。通常检测的分子大事是基因功能，具有可测性的是发光。目前，市场上有很多发光报告基因出售。包括：萤火虫荧光素酶〔fireflyluciferase〕，β－半乳糖苷酶〔B-galactosidase〕等。2〕ATP水平测定：全部活细胞都含有ATP。ATP可以从细胞中提取出来，用萤火虫荧光素酶检测。荧光强度与样品中ATP的含量成比例，相应的与提取ATP所用的细胞数成比例。可以检测样品中的全部微生物，因而被用于检测水中的大肠杆菌含量，用于药品，化装品，牛奶以及其它食品的微生物掌握，测定土壤和沉积物中的全部活生物含量，评价抗生素对微生物生长的影响，了解不同药物对哺乳动物细胞的影响等。3〕离子测定：如细胞内钙离子测定。活细胞内钙离子浓度测定的方法即从测量出的荧光信号中定量地计算出钙离子浓度。对于单波长激发或放射的荧光指示剂，可按下式计算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F)，Kd：荧光剂与Ca2+形成协作物的解离常数，Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。对于双波长的荧光指示剂，用率Ca2+浓度，用下式计算细胞内游离Ca2+浓度，[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(RRmin)/(RmaxR)Kd：荧光剂与Ca2+形成协作物的解离常数.Fd和Fs分别表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时的荧光强度.，R为试验观看到的荧光比值.Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值.，Rmax为胞Ca2+饱和时的荧光比值.fura2Fura2:由紫外激发的一种率测量指示剂，因有较强的亲水性，难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AMFura-2/AMFura-2Fura-2Fura-2Ca2+结合后吸取峰Ca2+浓度时,它的最大吸取峰分别在335nm和363nm处，在作率测量时，常常选用的波长是340nm和380nm；结合钙和游离钙形式Fura2的放射峰都是510nm，其放射光的强度与钙离子的浓度呈比例关系第四章荧光细胞激活分选、分析简述流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光染色后由气压装置送入流淌室,流淌室由样品管和鞘液管组成,鞘液管布满流淌的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差到达肯定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区。经激光束激发,产生散射光和荧光信号。通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。简述流式细胞仪的构造2〕3〕光学系4〕5〕细胞分选系统前向角散射定义(FSC，ForwardScatter)前向角散射(FSC，ForwardScatter)：0°散射,与被测细胞的大小和面积有关，精准说与细胞直径的平方亲热相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排解样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避开对被测细胞干扰。侧向角散射定义(SSC，SideScatter)侧向角散射(SSC，SideScatter)：90°散射,对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可供给有关细胞内精细构造和颗粒性质的信息。5AnnexinV/PI根本原理：细胞凋亡早期转变发生在细胞膜外表，这些细胞膜外表的转变之一是磷脂酰丝氨酸〔PS〕从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外外表。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV是一种Ca2+依靠的磷脂结合蛋白,具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。该蛋白可充当敏感的探针检测暴露在细胞膜外表的PS。6PI〔碘化丙啶〕染色时消灭细胞凋亡峰的原理在凋亡细胞内，由于细胞核的解聚和凋亡小体的形成，核内的总DNA含量下降。由于在凋亡细胞内DNA含量下降，在G1峰前消灭G1试述PI〔碘化丙啶〕染色应用流式细胞仪检测细胞周期的原理DNADNA式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1／G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进展检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1／G0期,S期和G2/M期,并可通过特别软件计算各时相的百分率。流式细胞仪的细胞分选原理流式细胞仪的分选功能是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现在这些液滴中。此时,细胞的荧光和散射光信号已被测量,经规律推断，给流束一个充电脉冲信号,小水滴就全部带上了正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中。与其他分选方法相比流式细胞分选的特点1〕少量细胞分选时，流式细胞分选精度高，速度快。先进的流式分选速度可达25000个细胞/秒以上；一次分别的最大合理量为108次方个细胞。2〕Marker43〕不仅仅限于外表标记物，流式细胞仪可以依据任何能检测到的散射光〔如细胞体积〕或荧光〔如DNA,RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原〕强度差异来分别细胞。4〕假设只是间或做几次细胞分选的话，用流式细胞分选还是比较划算，只需预备样品和抗体，交纳肯定的仪器使用费用即可，不需要购置配套的设备。同型比照同型比照是使用与一抗一样种属来源、一样亚型、一样剂量和一样的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消退由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型比照是真正意义上的阴性比照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮助省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤可能代表了一群更原始的干细胞,且与干细胞的可塑性相关.LCM激光器1.〕单色性好，易于分别，2〕.方向性好3〕.亮度高，强度，而放射光能通过分光镜进入后续的检测系统。2〕.滤光镜：能够选择出肯定波长范围