第五章分子生物学研究方法演示文稿

第五章分子生物学研究方法演示文稿1本文档共109页；当前第1页；编辑于星期三\12点22分2优选第五章分子生物学研究方法本文档共109页；当前第2页；编辑于星期三\12点22分基因克隆（genecloning）经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程，通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。本文档共109页；当前第3页；编辑于星期三\12点22分本文档共109页；当前第4页；编辑于星期三\12点22分基因克隆的五个步骤分、切、连、转、选本文档共109页；当前第5页；编辑于星期三\12点22分基因克隆需要什么？目的基因载体宿主基因操作方法本文档共109页；当前第6页；编辑于星期三\12点22分基因克隆目的基因序列已知目的基因序列未知本文档共109页；当前第7页；编辑于星期三\12点22分专题一：序列已知基因的克隆策略5.1聚合酶链式反应技术5.2载体的发现及其应用5.3工具酶的发现和应用5.4细菌转化与目标DNA分子的增殖5.5核酸凝胶电泳技术本文档共109页；当前第8页；编辑于星期三\12点22分5.1聚合酶链式反应技术Polymerasechainreaction(PCR)wasdevelopedin1983byKaryMullis.In1993,MulliswasawardedtheNobelPrizeinChemistryalongwithMichaelSmithforhisworkonPCR.PCRamplifiesDNAsbyrepeatedroundsofDNAreplicationinvitro.本文档共109页；当前第9页；编辑于星期三\12点22分PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。本文档共109页；当前第10页；编辑于星期三\12点22分本文档共109页；当前第11页；编辑于星期三\12点22分1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍本文档共109页；当前第12页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃本文档共109页；当前第13页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物本文档共109页；当前第14页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶本文档共109页；当前第15页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始本文档共109页；当前第16页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq本文档共109页；当前第17页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束本文档共109页；当前第18页；编辑于星期三\12点22分PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点本文档共109页；当前第19页；编辑于星期三\12点22分PCR的原理示意图本文档共109页；当前第20页；编辑于星期三\12点22分聚合酶链式反应（PCR）技术本文档共109页；当前第21页；编辑于星期三\12点22分PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较本文档共109页；当前第22页；编辑于星期三\12点22分PCR过程的“三个步骤”变性（90℃-98℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。本文档共109页；当前第23页；编辑于星期三\12点22分PCR反应程序95℃5min95℃30S55℃30S72℃1min72℃10min4℃30个循环本文档共109页；当前第24页；编辑于星期三\12点22分PCR反应体系的“五个要素”模板引物dNTP缓冲液（其中需要Mg2+）DNA聚合酶本文档共109页；当前第25页；编辑于星期三\12点22分PCR反应体系10×扩增缓冲液10μLMg2+1.5mmol/L4种dNTP混合物200μmol/L引物110～100pmol引物210～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5μ加双或三蒸水100μL本文档共109页；当前第26页；编辑于星期三\12点22分DNA聚合酶（DNApolymerase）TaqDNApolymerase，1976年从粞热水生菌（Thermusaquaticus）分离，耐高温，具有5’-3’外切酶活性，不具有3’-5’外切酶活性，PCR产物具有3'突出的单A核苷酸尾。PfuDNApolymerase，从火球菌（Pyrococcusfuriosis）分离，耐高温，不具有5’-3’外切酶活性，具有3’-5’外切酶活性，PCR产物为平末端。本文档共109页；当前第27页；编辑于星期三\12点22分模板（Template）单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。可以是复杂样品。本文档共109页；当前第28页；编辑于星期三\12点22分引物（primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer本文档共109页；当前第29页；编辑于星期三\12点22分

引物设计原则（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。本文档共109页；当前第30页；编辑于星期三\12点22分3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记本文档共109页；当前第31页；编辑于星期三\12点22分引物设计软件PrimerPremier5.0OligoFPCRPrimer-Blast本文档共109页；当前第32页；编辑于星期三\12点22分PCR反应的特点特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低

本文档共109页；当前第33页；编辑于星期三\12点22分PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……本文档共109页；当前第34页；编辑于星期三\12点22分PCR的种类基因组PCR反（逆）转录PCR实时定量PCR扩增已知序列两侧DNA的PCR致突变PCR扩增未知DNA序列的PCR重组PCR推荐书目《PCR最新技术原理、方法及应用》，黄留玉主编

本文档共109页；当前第35页；编辑于星期三\12点22分载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；5.2

载体的发现及其应用本文档共109页；当前第36页；编辑于星期三\12点22分载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。本文档共109页；当前第37页；编辑于星期三\12点22分载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件本文档共109页；当前第38页；编辑于星期三\12点22分39GeneralfeaturesofaVectorTheycontainanoriginofreplicationandcanautonomouslyreplicatingDNA

independentofhost’sgenome.Containsatleastone

selectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.Containsa

multiplecloningsite(MCS)tobecutbyrestrictionenzymesforDNAmanipulation.Easilytobeisolated

fromthehostcell.Mostarecircular,somearelinear(e.g.YACvector).本文档共109页；当前第39页；编辑于星期三\12点22分用于基因克隆的载体质粒载体：10kb以下噬菌体载体：20kb黏粒（cosmid）噬菌体：50kb人工染色体：200kb-1Mb土壤农杆菌Ti质粒：植物细胞，200kb本文档共109页；当前第40页；编辑于星期三\12点22分质粒Plasmids:small,extrachromosomalcircularmolecules,from2to~200kbinsize,whichexistinmultiplecopieswithinthehostcells.严紧型质粒拷贝数1-2/cell松弛型质粒拷贝数>10/cell本文档共109页；当前第41页；编辑于星期三\12点22分克隆载体和表达载体克隆载体（CloningVector）

可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并能自我复制的DNA分子。此种DNA分子含有能在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。

表达载体（ExpressionVector）

在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。本文档共109页；当前第42页；编辑于星期三\12点22分本文档共109页；当前第43页；编辑于星期三\12点22分本文档共109页；当前第44页；编辑于星期三\12点22分限制性内切酶（Restrictionendonuclease）DNA连接酶（DNAligase）反转录酶（Reversetranscripatase）碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase）DNA聚合酶（DNApolymerase）5.3工具酶的发现和应用本文档共109页；当前第45页；编辑于星期三\12点22分1970年，Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了EcoRI一类重要的限制性内切酶。

1）限制性内切酶的发现和应用本文档共109页；当前第46页；编辑于星期三\12点22分限制性内切酶（restrictionendonuclease）定义：能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。限制性外切酶：是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3’,5’-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸。本文档共109页；当前第47页；编辑于星期三\12点22分本文档共109页；当前第48页；编辑于星期三\12点22分Whybeingused?--TobreaklargeDNAmoleculesintomanageablefragments.Nucleicacids-RestrictiondigestionRestrictionendonucleases(限制性内切酶)cleaveDNAmoleculesatparticularsitesby

therecognitionofspecificsequences.本文档共109页；当前第49页；编辑于星期三\12点22分来源：细菌的限制－修饰系统。命名：微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。限制性内切酶本文档共109页；当前第50页；编辑于星期三\12点22分51the1stsuchenzymefoundEscherichiacoli

SpeciescategoryR13strainHowtonamearestrictionendonuclease?EcoRI本文档共109页；当前第51页；编辑于星期三\12点22分限制性核酸内切酶的分类I型限制酶

属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，随机切割。II型限制酶

识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复顺序(回文结构)，具有180º的旋转对称性，特异性切割。III型限制酶

在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。本文档共109页；当前第52页；编辑于星期三\12点22分53REusedinmolecularbiologytypicallyrecognize(识别)short(4-8bp)targetsequencesthatareusuallypalindromic(回文结构),andcut(切割)atadefinedsequencewithinthosesequences.e.g.EcoRI5’….GAATTC.….3’

….CTTAAG….本文档共109页；当前第53页；编辑于星期三\12点22分54Therandomoccurrenceofthehexameric(六核苷酸的)sequence:

1/4096(4-6=1/46)Whatarethefrequenciesiftherecognitionsequencesarefour(tetrameric)andeight(octameric)nucleotides?HowtoestimatethefrequencyoftheREinaDNAmoleculeorgenome?本文档共109页；当前第54页；编辑于星期三\12点22分55Table1SomerestrictionEndonucleasesandtheirrecognitionsequencesEnzymeSequenceFrequencySau3A1EcoRINotI5’-GATC-3’5’-GAATTC-3’5’-GCGGCCGC-3’0.25kb4kb65kb本文档共109页；当前第55页；编辑于星期三\12点22分56(1)Restrictionenzymesdifferintherecognitionspecificity:targetsitesaredifferent.

(2)Restrictionenzymesdifferinthelengththeyrecognized,andthusthefrequenciesdiffer.

(3)RestrictionenzymesdifferinthenatureoftheDNAendstheygenerate:blunt/flushends(平末端),sticky/staggeredends(粘性末端).

(4)Restrictionenzymesdifferinthecleavageactivity.CharacteristicsofRE本文档共109页；当前第56页；编辑于星期三\12点22分57stickyends(粘性末端)bluntends(平末端)

Fig2Recognitionsequencesandcutsitesofvariousendonucleases本文档共109页；当前第57页；编辑于星期三\12点22分<1>同裂酶（isoschizomer）：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。

5’CCGG3’3’GGCC5’

5’

C

CGG3’3’GGC

C

5’HpaII、MspI少数有特殊性质的II型酶本文档共109页；当前第58页；编辑于星期三\12点22分<2>同尾酶（isocaudarner)：作用后能产生相同的粘性末端。5’GGATCC3’3’CCTAGG5’5’AGATCC3’3’CCTAGA5’BamHIBagII本文档共109页；当前第59页；编辑于星期三\12点22分几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端本文档共109页；当前第60页；编辑于星期三\12点22分1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。2）DNA连接酶的发现和应用本文档共109页；当前第61页；编辑于星期三\12点22分

DNA连接酶

（DNAligase）一种封闭DNA链上缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶

本文档共109页；当前第62页；编辑于星期三\12点22分连接反应体系三蒸水0.5μL目的基因

6μL载体

2μL缓冲液1μL连接酶

0.5μL温度4℃,16℃本文档共109页；当前第63页；编辑于星期三\12点22分DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。T4噬菌体DNA连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子。DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶。注意：本文档共109页；当前第64页；编辑于星期三\12点22分5.4细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。本文档共109页；当前第65页；编辑于星期三\12点22分为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。感受态细胞（competentcells）本文档共109页；当前第66页；编辑于星期三\12点22分CaCl2法大肠杆菌培养至0℃预处理的低渗CaCl2-甘油溶液42℃90s或37℃5min转化效率：5×106~2×107个/µgDNA。

本文档共109页；当前第67页；编辑于星期三\12点22分电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电击杯中进行电击。本文档共109页；当前第68页；编辑于星期三\12点22分电穿孔仪电击杯本文档共109页；当前第69页；编辑于星期三\12点22分细菌转化及蓝白斑筛选（Blue-whitescreening）本文档共109页；当前第70页；编辑于星期三\12点22分5.5核酸凝胶电泳技术一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。本文档共109页；当前第71页；编辑于星期三\12点22分核酸电泳的用途确定DNA或RNA的大小纯化DNA或RNA片段分离DNA或RNA片段本文档共109页；当前第72页；编辑于星期三\12点22分Fig3:DNAisseparatedbygelelectrophoresislargemoderate

small本文档共109页；当前第73页；编辑于星期三\12点22分741.DNAandRNAmoleculesarenegativelycharged,thusmoveinthegelmatrix(胶支持物)towardthepositivepole(正电极).2.LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.ThelargeDNAmoleculesmoveslowerthanthesmallmolecules.3.ThemobilityofcircularDNAmoleculesisaffectedbytheirtopologicalstructures.ThemobilityofthesamemolecularweightDNAmoleculewithdifferentshapesis:supercoiled(超螺旋)>linear(线性)>nickedorrelaxed(缺刻或松散)

DNAgelmobility(DNA在胶上的迁移性)本文档共109页；当前第74页；编辑于星期三\12点22分75Gelmatrix(胶支持物)isaninserted,jello-likeporousmaterialthatsupportsandallowsmacromoleculestomovethrough.Gelmatrix(胶支持物)本文档共109页；当前第75页；编辑于星期三\12点22分76Agarose(琼脂糖):amuchlessresolvingpowerthanpolyacrylamide,butcanseparateDNAmoleculesofuptotensofkb1kb0.5kb2kb3kb4kbDNAcanbevisualizedbystainingthegelwithfluorescentdyes,suchasethidiumbromide(EB溴化乙锭)本文档共109页；当前第76页；编辑于星期三\12点22分77Polyacrylamide

(聚丙稀酰胺):hashighresolvingcapability,andcanresolveDNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.butcanonlyseparateDNAoveranarrowsizerange(1toafewhundredbp).本文档共109页；当前第77页；编辑于星期三\12点22分凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）

0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1本文档共109页；当前第78页；编辑于星期三\12点22分溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。本文档共109页；当前第79页；编辑于星期三\12点22分常用缓冲液TAE：Tris-乙酸缓冲容量小，溶解度大，易储存，可用于核酸纯化。TBE：Tris-硼酸缓冲容量大，溶解度小，不易储存，不用于核酸纯化。TPE：Tris-磷酸缓冲容量大，不可用于核酸纯化。本文档共109页；当前第80页；编辑于星期三\12点22分5.1聚合酶链式反应技术5.2载体的发现及其应用5.3工具酶的发现和应用5.4细菌转化与目标DNA分子的增殖5.5核酸凝胶电泳技术专题一：序列已知基因的克隆策略本文档共109页；当前第81页；编辑于星期三\12点22分部分考研题Blue-whitescreening（武汉大学2008）Vector（上海交大2004，浙江大学2004、2006）聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）（北京师范2008）限制性酶图谱（华南理工2005）黏性末端（南京师范2006）同裂酶（南京师范2006）设计PCR引物的主要原则是什么？（中科院2007）描述PCR技术原理（浙江大学2004、2006）分子生物学研究中经常用各种载体进行研究工作，试问有哪些不同大小类型的载体，各自的主要特点是什么？（武汉大学2005、2009）碱法质粒提取用到的溶液成分的作用时什么？操作中有哪些注意事项？（北京大学2010）本文档共109页；当前第82页；编辑于星期三\12点22分思考题请设计一组试验来①克隆一个你所感兴趣的人类基因；②并对基因产物大量表达与纯化；③然后研究该基因的生物学功能。（武汉大学2005）本文档共109页；当前第83页；编辑于星期三\12点22分专题二：序列未知基因的克隆策略5.6构建基因组文库5.7构建cDNA文库5.8文库筛选5.9RACE本文档共109页；当前第84页；编辑于星期三\12点22分85LibrariesofDNAmoleculescanbecreatedbycloning(GenomiclibraryandcDNAlibrary)ADNAlibrary(DNA文库)isapopulationofidenticalvectorsthateachcontainsadifferentDNAinsert.GenomicLibrary(基因组文库):theDNAinsertsinaDNAlibraryisderivedfromrestrictiondigestionorphysicalshearingofthegenomicDNA.cDNAlibrary(cDNA文库):theDNAinsertsinaDNAlibraryisconvertedfromthemRNAsofatissue,acelltypeoranorganism.cDNAstandsfortheDNAcopiedfrommRNA.本文档共109页；当前第85页；编辑于星期三\12点22分5.6基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。本文档共109页；当前第86页；编辑于星期三\12点22分Clark和Carbon于1975年提出公式：

N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。本文档共109页；当前第87页；编辑于星期三\12点22分构建基因组文库最常用的是λ噬菌体载体（克隆能力约15—20kb）和限制性内切酶部分消化法。本文档共109页；当前第88页；编辑于星期三\12点22分5.7cDNA文库的构建1总RNA的提取2mRNA的纯化3cDNA的合成4cDNA文库的构建cDNA文库的构建过程本文档共109页；当前第89页；编辑于星期三\12点22分细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5μgRNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA的1%-5%1总RNA的提取本文档共109页；当前第90页；编辑于星期三\12点22分总RNA的抽提方法异硫氰酸胍-苯酚抽提法(TRIzol法)硅胶膜纯化柱本文档共109页；当前第91页；编辑于星期三\12点22分RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/OD280的比值将明显低于1.8。本文档共109页；当前第92页；编辑于星期三\12点22分RNA的琼脂糖电泳检测变性条件下，甲醛是最常用的变性剂，也可用加热或尿素等变性剂。28S和18S亮度2:1rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。本文档共109页；当前第93页；编辑于星期三\12点22分2mRNA的纯化5’端帽子结构和3’端的polyA尾巴寡聚(dT)-纤维素柱色谱法本文档共109页；当前第94页；编辑于星期三\12点22分PolyATTractmRNA的分离纯化过程简图。本文档共109页；