人类细胞质的提取等

关于人类细胞质的提取等第1页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三Contents1.人类细胞质RNA的提取2.RT-PCR的原理、方法3.琼脂凝胶电泳结果分析及应用第2页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三人类细胞质RNA的提取

真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。

第3页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三

人类细胞质RNA的提取·分析不同发育时期基因的表达状况·获得新基因AIMS·研究基因的拼接·分析相应的蛋白产物第4页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三

人类细胞质RNA的提取原理：RNA的不稳定性

由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性，从而达到成功提取RNA。第5页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三人类细胞质RNA的提取常用RNA酶抑制剂：

焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。第6页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三人类细胞质RNA的提取

RNA提取的一般步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA

破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行可以用盐酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎组织加入β-巯基乙醇可以抑制RNA酶活性

分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH=5.2）或异丙醇。

第7页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三人类细胞质RNA的提取④洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解⑤融解RNA一般使用TE（三羟甲基氨基甲烷和EDTA配置而成）⑥保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase（核糖核酸酶）的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此第8页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三

RT-PCR

的原理及方法

RT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。第9页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三

RT-PCR

的原理及方法

背景

基因的表达

＊不同细胞或组织表达不同的基因基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物第10页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三RT-PCR

的原理及方法目的通过反转录(reversetranscription，RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度第11页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三RT-PCR

的原理及方法原理及方法mRNA

(messengerRNA)cDNA(complementaryDNA)

PCR产物RT(反转录)

PCR(聚合酶链反应)第12页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三RT-PCR

的原理及方法第13页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三Diagram第14页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种方法。与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。第15页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三琼脂糖凝胶电泳TEXTTEXTTEXTTEXT原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可第16页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三琼脂糖凝胶电泳PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳检测

在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以Marker(分子质量标准)作为参照，用≤5V/cm的电泳30-60分钟，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。第17页，讲稿共20页，2023年5月2日，星期三琼脂糖凝胶电泳

应用（广泛应用与分子生物学、遗传学和生物化学）分离提取大分子DNA可区分相差100bp的DNA片段测定糖化血红蛋白PCR扩增产物的检测免疫扩散法利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物第18页，讲稿共20页，2023年5月2日，星