外源DNA残留量测定(荧光定量PCR法)标准操作规程SOP

外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程文件编码：XXXXXX目录\l“_TOC_250008“目的 1\l“_TOC_250007“范围 1\l“_TOC_250006“职责 1\l“_TOC_250005“依据 1\l“_TOC_250004“定义 1\l“_TOC_250003“内容 1原理 1试验材料 1操作步骤 3结果计算 6判定标准 7留意事项 7\l“_TOC_250002“相关文件 7\l“_TOC_250001“附件 7\l“_TOC_250000“变更历史 7外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程目的DNA残留量测定法〔PCR法〕的操作过程。范围PCRCHODNA残留量的测定。职责方法学争论员负责严格执行本规程规定；质量争论室负责人负责本规程的培训并监视本规程的执行。依据DNA残留量检测样品处理试剂盒〔PrepSEQTMResidualDNASamplePreparationkit，AppliedBiosysterms〕使用说明书。定义LTR：longtandemrepeat，长串联重复序列PCR：PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反响Ct：阈值循环，即荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经受的循环数内容原理CHO工程细胞所表达的蛋白质产品，其外源性DNA残留量的测定承受荧光定量PCRCHO细胞中含量较丰富的CHODNA做标准曲线，通过对DNA的含量。试验材料文件编码：SOP0302025-01 第1页/共7页外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程试药与试液灭菌水的超纯水，12120分钟以上。本方法全部试液均用灭菌水配制。1mol/LTris-HCl缓冲液〔pH=8.0〕60.57g〔400mlpH500ml。室温保存。溶液〔pH=8.0〕400mlpH8.0，500ml。室温保存。TE缓冲液5ml，0.5mol/LEDTA1ml500ml。室温保存。NaCl溶液200ml。室温保存。DNA残留量检测样品处理试剂盒PrepSEQTMResidualDNASamplePreparationkit购自AppliedBiosystems，cat：4413686，依据试剂盒说明将各组分分别贮存于室温或冰箱。预混溶液4℃保存，避开屡次冻融。CHO-49引物探针探针引物序列如下：文件编码：SOP0302025-01 第2页/共7页外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程下游引物：gATTgTTgTgAgCCACCATgTg；引物混合物的配制：将上下游引物分别用TE27μmol/L，等体积混合后分装，-20℃保存。TE10μmol/L后分装，-20℃保存。标准物质CHO细胞DNA国家标准品-20℃保存。仪器与用具台、涡旋混合仪、水浴锅、移液器、防气溶胶带滤芯移液器吸头、磁力架〔AppliedsR反响管/板。操作步骤标准曲线稀释CHODNA国家标准品TE3×105pg/ml后，按下表分别进展10倍梯度稀释。Tube编号稀释方法DNA浓度(pg/ml)SD1/3×105SD250μlSD1+450μlTE3×104SD350μlSD2+450μlTE3×103SD450μlSD3+450μlTE300SD550μlSD4+450μlTE30SD650μlSD5+450μlTE3文件编码：SOP0302025-01 第3页/共7页外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程样品处理依据各品种项下具体要求，进展样品处理；如需承受试剂盒对样品进展残留DNA提取，应按以下步骤进展：100μl200μl2.0ml的离心管，一般每批样品做三个平行。200μl2.0ml的离心管，并参加适量阳性DNA2~10倍。提取阴性比照〔100μl200μlE2.0ml为提取阴性比照。10μl〔100μl样品〕NaCl溶液，调整盐离子的含量。K70μl〔100μl样品，其中含蛋白酶K10μlK60μl。5630分钟。LysisbufferSolutionMix的配制：Glycogen〔5mg/ml〕180μl、tRNAμl、LysisBuffer7600μl360μl〔100μl样品。37℃水浴处理磁性纳米颗粒〔MagneticParticles〕10分钟，涡旋振荡使其充分30μl〔100μl样品，用吸头上下吸动几次混匀。300μlgn〔100μl样品，颠倒离心管两次，涡旋5分钟。快速离心15秒，将离心管放到磁力架上5分钟或直到溶液变清，吸掉上清。300μlh〔100μl样品，来回颠倒离心管两次，涡旋5秒。1分钟，吸掉上清。以一样的方法用重复洗涤样品一次，最终将离心管管底的残留液体吸干。文件编码：SOP0302025-01 第4页/共7页外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程翻开离心管管盖，室温放置20分钟，让残留管壁的液体挥发晾干。100l的洗脱缓冲液nr，让磁性纳米颗粒充分悬浮。7010分钟，在水浴过程中涡旋震荡离心管三次。21.5ml的离心31分钟。1.5mlPCR反响。检测6.3.1。30分钟。加样PCR反响体系如下：加样成分PremixExTag〔2×〕RoxReferenceDye〔50×〕各探针〔10μmol/L〕TE缓冲液模板

每个反响体系加样体积15μlμl1.67μl0.9μl1.83μl10μl预先混合。反响管/20μlDNA标准品、提取阴性比照〔、阴性比照〔CE缓冲液、待测样品、加标样10μl3个平行。文件编码：SOP0302025-01 第5页/共7页外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程翻开计算机和检测软件(SDS2.0.6)。1：95℃，30秒；40个循环；反响体系体积：30μl。7500PCR仪中运行反响。PCR运行完毕后，点击“Analysis”按钮，分析试验结果。结果计算计算试验结果：承受检测软件分析数据，得到标准曲线相关系数、各供试品Ct值、各供试品定量值等结果。依据以下公式计算回收率：加标样品定量值〔pg/ml〕－待测样品定量值〔pg/ml〕回收率〔%〕＝ ×100%DNA终浓度〔pg/ml〕值应≥0.990Ct值应低于标Ct50%~150%之间。DNA残留量的计算如无特别规定，按以下方式进展计算。如待测样品定量值位于标曲范围内，按以下公式进展计算：DNA残留量〔pg/剂量〕＝

待测样品定量均值〔pg/ml〕×剂量〔mg/剂量〕待测样品浓缩倍数×蛋白质含量〔mg/ml〕3pg/ml3pg/ml进展限度分析，计算公式如下：文件编码：SOP0302025-01 第6页/共7页外源性DNA残留量测定法〔荧光定量PCR法〕标准操作规程DNA残留量〔pg/剂量〕＜判定标准见各品种项下要求。留意事项

方法定量限〔pg/ml〕×剂量〔mg/剂量〕待测样品浓缩倍数×蛋白质含量〔mg/ml〕PCR反响有抑制作用，应留神操作，避开带入定量反响体系中。反响、反响