干细胞研究进展讲稿

干细胞研究进展组胚：郭雨霁1981年Evans等成功地建立了小鼠的ESC系；1995年Thompson等建立了第一株灵长类动物的ESC系；1998年11月，美国威斯康星大学的科学家在美国《科学》杂志报告说，他们已成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖；1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度世界十大科学进展之首;1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性;2001年末,干细胞研究又被其列为六大热门科技领域之首;干细胞的话题沸沸扬扬地充斥在全球各种新闻媒体2001年4月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。2006年两项研究成果标志着干细胞技术正从一种概念，转变成能够看得见的事实：美国科学家利用胚胎干细胞所衍生的运动神经元让瘫痪的老鼠恢复了行走能力；英国科学家从胚胎干细胞中培育出来的精子，并使之与卵细胞结合，生育出幼鼠。2010年1月韩国《朝鲜日报》报道，韩国建国大学兽医学院教授利用人类脐带血干细胞成功治愈了脊髓受伤导致两条后腿瘫痪的狗。分离和体外培养各种来源的干细胞的技术不断成熟,更是引发了新一轮的干细胞研究热潮。美国加州每年提供干细胞研究经费达3亿美元。我国的干细胞研究也很活跃，“863”计划近期将为干细胞研究提供2亿元人民币的经费。2000年日本启动“千年世纪工程”，干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达108亿日元。到底干细胞是什么东西，为何会受到如此的关注？干细胞是潜力无穷？还是被我们过度期待？干细胞（stemcells）是一类能够进行自我更新（self-renew）和尚未分化

（un-differentiated具有分化潜能）的细胞；可以分化为多种组成人体的组织或器官的细胞类型。自然存在的各种干细胞多能(pluripotent)干细胞(胚胎干细胞、胚胎生殖细胞)单能(unipotent)干细胞(成体干细胞)造血干细胞其他组织特异性干细胞（神经、肺部干细胞等）特化细胞红细胞血小板白细胞全能(totipotent)干细胞

(受精卵)Thefertilizedovumistheoriginofthelife.滋养层胎盘及胎儿的附属结构卵黄囊尾侧壁上的内胚层细胞是原始生殖细胞的发源地。后经肠系膜迁移至生殖腺嵴。多能干细胞pluripotentstemcells：

a、来源：胚胎干细胞—内细胞群细胞胚胎生殖细胞—原始生殖细胞

b、特点：可进行克隆性增殖而不发生分化，保持二倍体核型不变；具有多向分化的潜能，在特定条件下可诱导分化为三个胚层来源的所有组织细胞；失去了发育形成生物个体的能力。

c、多分化潜能性的实验证据：嵌合体实验畸胎瘤实验类胚体实验单能干细胞unipotentstemcells：

成体干细胞/组织特异性干细胞

a、特征：能自我复制,有分化潜能,但只能分化为所在组织的功能细胞。

b、存在部位：骨髓,周围血液,脑,脊髓,血管,骨骼肌,表皮,

消化管,角膜,视网膜,肝,胰等

c、可塑性：横向分化

特化细胞specializedcells：

具有特定形态结构、分子标记和功能，不能进行分化。横向分化：通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。部分干细胞在特定条件下可以转化为其它胚层来源的细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞等。1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞。ESC和成体干细胞的异同相同点：都具有干细胞的自我复制和分化能力，都有“归巢”现象。干细胞是一类能够进行自我更新和具有分化潜能的细胞（具有分裂增殖能力，干细胞本身不是处于分化途径的终端）。干细胞通过两种方式生长*对称分裂---形成两个相同的干细胞*不对称分裂---由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。干细胞的共同特征干细胞增殖的缓慢性干细胞增殖的自稳性区别于肿瘤细胞的本质性特征。有利于其对特定的外界信号做出反应，以决定是进入增殖还是进入分化程序，同时有利于减少干细胞内基因突变的危险。

研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于许多疾病的治疗，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。干细胞的应用胚胎干细胞embryonicstemcells

干细胞相关技术：克隆clone

转基因技术transgenictechnology成体干细胞：神经干细胞neuralstemcells

肺干细胞pulmonarystemcells诱导型多能干细胞inducedpluripotentstemcell主要内容第2周第3周胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）是从早期胚胎的内细胞团中分离出来的一种高度未分化、具有多向分化潜能的细胞。1981年Evans等从囊胚的内细胞群中成功分离、建立了小鼠的ESC系1998年Thomson和Gearhart分别用胚泡内细胞团细胞和原始生殖细胞成功地建立了人的ESC系

在全球范围内掀起了ESC的研究热潮。胚胎干细胞

ESC的体外培养建系定向诱导分化在生物医学上的应用早期小鼠胚胎的获得：

受精后第4天上午，取出孕子宫，将输卵管端夹闭，由阴道端插入5号针头注入冲胚液，至宫腔达到一定压力，突然松开输卵管侧，即可获得发育至囊胚期的早期胚胎。选取发育良好的囊胚接种在饲养层细胞上。从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC子宫小鼠早期胚胎的体外培养---饲养层：饲养层细胞的作用：

培养的鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，可用作饲养层细胞。饲养层细胞经丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但仍然保持生存活性，并为胚胎干细胞的存活、增殖和未分化状态的维持提供一些必需因子，还可去除培养环境中的毒素和代谢抑制因子。饲养层细胞的处理方法如下：

取P12-16的孕鼠，剖腹取胚胎，去除头、四肢、内脏后，Hanks液反复冲洗，剪碎鼠胚组织，胰酶消化成单细胞悬液，接种，即为原代培养鼠胚成纤维细胞。将原培养液弃去，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养液作用2-4h，然后胰酶消化制成单细胞悬液，接种在四孔板中备用。

从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC小鼠早期胚胎的体外培养：从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESCESC的分离培养：

待小鼠囊胚贴壁，并从透明带中孵出后，在显微操作仪下分离内细胞团，吸出内细胞团，用胰酶消化，将其离散成小的细胞团块，接种于新的铺有饲养层细胞的四孔板中。一周后即可出现ESC集落。从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESCESC的分离培养---饲养层：

ESC体外培养的条件非常严格，为了维持ESC的未分化状态，在体外培养过程中，必须有饲养层或其它分化抑制剂的支持，适宜的饲养层培养体系是ESC体外培养扩增的一个关键环节。从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC原代鼠胚成纤维细胞（primarymouseembryonicfibroblast，PMEF）以其易于取材、分化抑制效果好等特点而被广泛应用。目前常用的饲养层有：STO（SIM小鼠成纤维细胞株，并为抗硫代鸟嘌呤6-thioguanine和鸟本箭毒素甙鸟巴因oualiain选择过的细胞）、PMEF(原代培养鼠胚成纤维细胞)、SNL(G418R基因和LIF基因转染的STO）、HBC-5637等。随着对人ESC研究的深入，来源于人ESC的组织器官可望用于临床。在体外培养人ESC时多使用PMEF作为饲养层，这样在ESC用于临床治疗时，可能带来鼠源性蛋白的污染而引起不良反应，所以有人尝试利用人胚胎成纤维细胞作饲养层进行人ESC的培养，并已有成功的报道。

饲养层细胞的抑分化功能来源于基质中的白血病抑制因子（leukemiainhibitingfactor,LIF），LIF最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤细胞条件培养基中被纯化的，是一种典型的多功能细胞因子。如：抑制骨髓白血病

m1细胞的增殖，诱导其向巨噬细胞方向分化；促进外周胆碱能神经分化和功能成熟；刺激破骨细胞增殖；调节肝细胞急性期反应蛋白的合成；抑制多能胚胎干细胞的分化等。

有学者向ESC培养基中加入LIF以取代饲养层细胞，辅以条件培养基即可维持ESC的多能性，从而消除饲养层细胞的干扰。

ESC的纯化：

待四孔板内长满ESC集落，未出现分化征象之前，用玻璃针挑取ESC集落，用胰酶消化，反复吹打离散后重新接种。集落呈克隆状生长，与饲养层细胞之间有明显的界限，细胞排列紧密，界限不清，可见折光性比较强的分裂相。从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESCESC特异性表面标记从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESCESC的鉴定---嵌合体制备技术：嵌合体（chimera）是指由两种或两种以上不同遗传构成的细胞构成的个体，这种个体的组织器官由基因型不同的细胞群组成。ESC能广泛参与宿主各组织的形成，尤其是生殖系的形成，成为嵌合体制备的最佳实验材料。嵌合体的成功制备也是证明ESC具有发育全能性的一个金指标。从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC嵌合体动物的制备方法主要有三种：融合法、显微注射法和共培养法。

融合法是指将来源于不同品系动物的早胚消化去透明带后，在融合剂（多用植物血球凝集素）的作用下，形成融合胚。实验过程中，由于消化剂、融合剂的使用，会对胚胎造成不同程度的损伤，所以融合法制备嵌合胚的成功率较低。共培养法是将着床前的早期胚胎与ESC进行共培养而获得嵌合胚的一种方法。虽然有资料表明，粘附在早期胚胎滋养层外面的ESC，经过过夜培养，能有效的与宿主ICM细胞整合，但是在共培养过程中，很难控制发生整合的ESC的数目，因此也限制了其使用。显微注射法应用最为广泛。通过显微注射法构建嵌合体是一项复杂的技术，ESC本身的特性、受体胚胎的品系来源以及显微注射的熟练程度等都会直接影响嵌合体的获得。第一部分C57BL/6JinbredmiceKMoutbredmiceEScellcultureSingle–cellsuspension5-10ESCmicromanipulatorreimplantationchimeraspseudopregnantfostermother(KM)

ESC的鉴定---嵌合体制备技术的应用：

目前，嵌合体制备技术已广泛应用于发育生物学、神经生物学、遗传学、肿瘤学、毒理学等众多研究领域，在当今生物医学研究中发挥着愈来愈重要的作用。在制备嵌合体之前，可以对ESC进行基因操作，获取一些优良性状，利用基因操作成功的ESC进行嵌合体的制备，如果出现生殖系嵌合，就可以把优良性状遗传下去。在家畜品种改良方面有广泛的应用。从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC人胚胎着床前的发育过程：从人囊胚的内细胞群中分离培养ESCtotipotencypluripotencyESC的诱导分化：

细胞分化celldifferentiation：在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生各不相同的细胞类群的过程。诱导induction：胚胎中的一个区域影响另一个区域，使其沿一条新途径进行分化；某些环境因子的刺激使基因进入转录状态。

ESC的诱导分化：胚胎干细胞在外界因素的刺激下逐渐发育为具有特殊形态和功能的专一细胞的过程。ESC的诱导分化干细胞移植治疗ESC分化形成的功能细胞就可以用于替代病变的功能细胞来行使功能。目前，在体外通过加入一些诱导剂或细胞因子进行诱导分化实验，还很难模拟体内的正常分化过程，任何一个诱导体系都不能保证诱导ESC定向分化为某一类型细胞，只能使某种类型的细胞趋于优势。ESC的诱导分化ESC的诱导分化ESC诱导分化的常用方法:

1.

加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、

bFGF、DMSO和RA等

2.

将ESC与特定的细胞共培养

3.

将某种分化诱导因子的基因转入ESC内

ESC的诱导分化ESC的神经诱导：

1.维甲酸（retinoicacid，RA）诱导：

维甲酸是维生素在体内的活性衍生物,是一种很强的分化诱导剂,它可诱导类胚体分化成多种细胞类型,其分化方向取决于维甲酸的作用阶段及剂量。

RA进入靶细胞后，由CRABP运送至细胞核，与核受体（RAR和RXR）结合。RXR自身或者与其他受体结合成同二聚体或异二聚体,识别DNA上维甲酸反应元件(RARE或RXRE),调控靶基因的表达，发挥重要的生物学效应，如调节细胞的分化、增殖和程序化死亡等。ESC的诱导分化1982年Jones-Willeneuve首次报道将RA运用于胚胎癌细胞（P19）向神经元细胞和神经胶质细胞的诱导,在24-48h内有神经样细胞移出。

Jones-VilleneuveEM,McBurneyMW,RogersKA,KalninsVI.Retinoicacidinducesembryonalcarcinomacellstodifferentiateintoneuronsandglialcells.JCellBiol.1982Aug;94(2):253-62.1995年Bain等人提出的“八日诱导程序”，即“4-/4+法”，是最经典的RA诱导法。他们将未分化的小鼠ES吹散，悬浮培养4天形成类胚体，再向培养液中加入0.5μMRA，培养4天，发现有38%的神经元样细胞。

BainG,KitchensD,YaoM,HuettnerJE,GottliebDI.Embryonicstemcellsexpressneuronalpropertiesinvitro.DevBiol.1995Apr;168(2):342-57.在胚胎细胞的正常分化过程中，诱导过程的实现不仅依赖于诱导物的诱导作用，同时也依赖于被诱导细胞的反应性，还有赖于两者之间在时间上和空间上的协调同步，这样才能保证被诱导细胞定向地分化为某种类型的细胞。2.序贯诱导法：2000年Lee等使用“五步法”序贯诱导小鼠ESC向神经细胞分化。扩增未分化的ESC；去除促有丝分裂素或分化抑制剂，悬浮培养，形成类胚体;去除生长因子，促分化，筛选nestin阳性细胞；扩增神经前体细胞；利用神经元促存活因子诱导并维持特定谱系神经元成熟。3.

神经分化的内定模式（defaultmodel）：

在对脊椎动物神经发育的研究中，有人发现外胚层细胞在无外界诱导信号下自发分化为神经细胞。经典的例子：Tropepe等人的实验发现，低密度、无血清、无饲养层的小鼠ESC培养7天后有0.2%左右的细胞可聚集形成神经球，其中82%的细胞呈nestin阳性着色。证明ESC能够自发分化为神经元。神经分化的内定模式认为在胚体原基中，神经谱系的分化受着某种抑制信号的控制，神经分化是抑制信号撤除后自发获得的一种状态。有资料表明：BMP4与这种抑制信号的转导密切相关，使用BMP4的拮抗剂Noggin、Chordin可抑制这种抑制信号的传导，从而促进ESC的神经分化。4.基因修饰：将神经特异性基因转染入ESC，筛选即可得到高纯度的神经细胞。将Nestin（神经前体细胞标志物）与报告基因增强性绿色荧光蛋白共同转染入ESC，筛选可得到高纯度的神经前体细胞。将促多巴胺能神经元生成的转录因子Nurr1转染入ESC，即可得到

Nurr1ESC系，再通过五步序贯诱导法，即可得到50%多巴胺能神经元，成为帕金森氏病细胞移植治疗的一个新的细胞来源。随着对神经发育分子机制的逐步了解，越来越多的与神经发生相关的基因被定位，这将为转染干细胞的研究提供更准确、有效的靶基因信息，前景非常诱人。但是由于基因修饰导致的基因组不稳定，导入基因可能引起的异常基因的表达，都需要学者进行进一步研究。哺乳动物的发育均需由1个全能细胞(受精卵)分化形成200多种不同类型的细胞。从囊胚期内细胞群分离得到的ESC在体外也具有无限或较长期的自我更新能力，并能在特定的诱导条件下分化为各种组织特异性细胞。

干细胞的调控是指给予适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。内源性调控外源性调控基因调控---干细胞应用的基础哺乳动物的发育均需由1个全能细胞(受精卵)分化形成200多种不同类型的细胞。从囊胚期内细胞群分离得到的ESC在体外也具有无限或较长期的自我更新能力，以及强大的分化潜能，能在特定的诱导条件下分化为各种组织特异性细胞。而且干细胞的增殖分化是可以受基因以及细胞外基质调控的。干细胞增殖分化的可调控性为干细胞带来了广阔的应用前景。理论上讲，干细胞可以用于许多疾病的治疗，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭、血液系统疾病等。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。细胞替代治疗制备转基因动物ESC的应用---细胞替代治疗：

最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病、白血病等。

ESC的应用ESC移植治疗的模式图

ESC技术+转基因技术随着对个体发育分子机制的逐步了解，越来越多的与组织发生相关的基因被定位，这将为转染干细胞的研究提供更准确、有效的靶基因信息，实现相对定向诱导分化，前景非常诱人。

但是由于基因修饰导致的基因组不稳定，导入基因可能引起的异常基因的表达，都需要学者进行进一步研究。源于胚胎干细胞的细胞已能或可能治疗许多疾病：神经细胞心肌细胞B型胰岛细胞软骨细胞白细胞皮肤细胞肝细胞骨细胞视细胞骨骼肌细胞帕金森病心肌梗死糖尿病骨关节炎白血病烧伤和创伤肝炎骨质疏松症视网膜退化肌营养不良治疗ESC的应用利用ESC移植治疗疾病确实具有广泛的应用前景，但是胚胎干细胞通常取自4-5天的早期胚胎，在分离过程中不可避免会损毁所使用早期胚胎，因此该项研究在欧美受到了社会伦理学的制约，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。核移植技术逐渐引起各国学者的关注。人们可望通过核移植技术获得杂合细胞发育成的囊胚，获得多能干细胞，然后将这些细胞回输入体内，从而达到治疗的目的。

核移植技术核移植技术

1938年,SpemanH在《EmbryonicDevelopmentandInduction》一书中提出了将分化了的细胞核移入去核卵细胞中看其是否能指导胚胎发育的异想天开的设想。

1952年,BriggsR和KingT通过移植蛙的胚胎细胞核到去核的卵子中得到发育正常的蝌蚪。

1981年,IllmenseeK和HoppePC声称通过核移植技术获得成活的小鼠。

1997年,WilmutI用成体乳腺细胞核移植克隆羊成功，“多莉”羊的出现震惊了世界,也使克隆clone一词成为家喻户晓的词汇。核移植技术困难重重克隆羊多莉Dolly的诞生

个体克隆羊多莉Dolly：

1997年2月22日，英国生物遗传学家维尔穆特成功地克隆出了一只羊。克隆羊“多莉”的诞生震惊了世界。“多莉”是世界上第一例用体细胞--乳腺上皮细胞，通过细胞核移植技术，得到的一只小绵羊。

多莉羊的诞生揭示一个全新概念：由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生命个体。克隆猴子Tetra：

2000年，美国俄勒冈地区灵长类动物研究中心的研究小组最近在著名的《科学》杂志上发表了他们克隆猕猴的成果。

克隆人的成功：

2002年12月克隆公司Clonaid法国成员BrigitteBoisselier表示，世界上第一个复制婴儿诞生。

2003年1月意大利妇科医生SeverinoAntinori称有复制人的妇女将生下婴儿。2009年3月，法新社报道，他已“制造”出3名“克隆人”，如今已有9岁。

牛,猪,马,骡子,猫,狗,兔等动物相继被克隆。带来世人的惊慌此项研究用了约434个卵子,获得277个重构卵,移植到中间受体6

后，冲出247个胚胎,其中发育到桑椹胚和囊胚的29个(11.7%)

。把29个胚胎移植给13只代母，最后生出1只“多莉”,产羔率仅为3.4%

。若以重构卵数计算,产羔率低于4‰。

克隆个体存在缺陷：被克隆动物即使能够出生，仍会有严重的不正常变异，巨大，寿命短表面上看起来正常的动物，也存在异常的基因表达模式发育过程中各阶段都会存在失控（epigeneticdysregulation）治疗性克隆在中国

“治疗性克隆”课题被列为国家级重点基础研究项目。此课题分为上、中、下游三块：上海市转基因研究中心成国祥教授负责上游研究上海第二医科大学盛惠珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。其整体目标是，用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织或器官移植到病人身上，从根本上解决同种异体器官移植过程中最难解决的免疫排斥反应。组织工程“人耳鼠”的制备：先用一种高分子化学材料聚羟基乙酸做成人耳的模型支架，让细胞在这个支架上繁殖生长，然后，在裸鼠的背上割开一个口子，将已经培养好的“人耳”植入后缝合。“人耳”支架最后会自己降解消失，于是，“人耳”便与老鼠浑然成为一体。干细胞为组织工程提供了一种很好的种子细胞。ESC的应用---转基因动物的制备：

外源目的基因的制备；外源目的基因的导入（受精卵或ESC）；转基因胚胎移植；筛选转基因动物品系。外源目的基因的制备--

利用限制性核酸内切酶，从基因组中获取目的基因；利用RNA合成cDNA；人工体外合成DNA片段；

PCR扩增特定基因片段。

转基因动物的应用领域主要有：疾病的动物模型：尤其是单基因遗传病。用于研究疾病的发病机理、药物筛选、药物治疗、毒物测试；通过导入或剔除基因（knock-inorknock-out）来研究基因的功能、调控和发育，如癌基因、发育基因等；生物反应器：药用或食品蛋白的大量生产，即转基因动物制药；异种器官的移植；家畜品种的改良。

转基因动物的应用冠脉搭桥术后注意事项

2017.01.08

冠状动脉粥样硬化性心脏病，指冠状动脉粥样硬化，造成血管壁增厚，官腔狭窄或阻塞造成心肌缺血缺氧，甚至坏死而引起的心脏病，简称“冠心病”。

一、发生因素:

1.血脂异常:

总胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白或极低密度脂蛋白增高，高密度脂蛋白降低。2.高血压:患此病的机率增高2-6倍，患此病者60%-70%有高血压。3.吸烟4.糖尿病5.肥胖6.其他:缺少活动，家族史，A型性格等。二、临床表现:

1.心绞痛

2.心肌梗塞

3.缺血性心脏病

三、治疗方法:

1.药物治疗:

扩冠，抗凝，控制血压，血糖，强心利尿

2.再灌注治疗:

溶栓治疗，介入疗法，冠状动脉搭桥术冠状动脉搭桥术:

是让心脏搏出的血升主动脉经过所架的血管桥，流向冠状动脉狭窄病变的远端，从而恢复缺血心肌的正常供血，这种