兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法

I兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了兰花细菌性褐腐病菌的分离培养、生理生化特征及分子生物学等检测鉴定方法。本标准适用于兰花植株中兰花细菌性褐腐病菌的检测鉴定及该病害的田间调查与监测。兰花细菌性褐腐病菌基本信息中文名：兰花细菌性褐腐病菌，杓兰欧文氏菌学名：Erwiniacypripedii（hori）Bergeyetal.1923异名：Pectobacteriumcypripedii（hori）Brenneretal.1973Pantoeacypripedii英文名：Bacterialsoftrotoforchid分类地位：细菌域Bacteria，变形菌门Proteobacteria，γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，肠杆菌目Enterobacteriales，肠杆菌科Enterobacteriaceae，欧文氏菌属Erwinia。传播途径：远距离传播主要靠带菌种苗，近距离传播主要借助叶面浇水、喷雾或施肥而将病原菌散播至健康植株上，通过叶片伤口及自然孔口侵染，造成二次感染。原理根据兰花细菌性褐腐病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测；根据兰花细菌性褐腐病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定。仪器设备和主要试剂仪器设备及用具PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Biolog仪、显微镜、高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量可调加样器、剪刀、解剖刀、玻璃棒、接种环、镊子、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、量筒、离心管、滤纸等。主要试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。商品化试剂参见其使用说明。NA培养基配制方法:蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，X脂17g，调节pH至7.2，用蒸馏水补充至1000mL，121℃高压灭菌15min。田间观察检测参照附录A中的症状描述观察植株是否有兰花细菌性褐腐病的典型症状，对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样。实验室检测样品制备选择有褐腐症状的植株，用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭病部表面进行表面消毒，用灭菌剪刀剪取新鲜病叶上的病健交界部位（无症状样品，随机选取叶片）组织置于培养皿内，用75%的乙醇（或1%的次氯酸钠）表面消毒50s～60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加适量无菌水，用灭菌玻棒或剪刀捣碎组织，静置15min～20min后，即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子生物学检测。分子生物检测模板制备按照6.1的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，-20℃保存备用。对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水浴10min；12000g离心10min，取上清液，-20℃保存）作为分子生物学检测反应模板。常规PCR检测对于叶片等植株样品，以已知带菌的兰花植株组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模拟带菌方式代替），以健康的兰花植株组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测。对于纯培养菌株，以E.cypripedii标准菌株作阳性对照，用非E.cypripedii的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录B。分离培养鉴定按照6.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在NA培养基上划线分离，28℃恒温培养24h后开始观察，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行致病性测定、BIOLOG鉴定、分子生物学鉴定。BIOLOG鉴定利用BIOLOG自动微生物鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定。致病性测定如果有争议或者有必要需按以下步骤对分离纯化的菌株进行致病性测定。将待测菌株在NA培养基上培养24h左右，用无菌水配成108CFU/mL左右的细菌悬浮液，用针刺法接种至健康兰花苗叶片上28℃保湿培养，接种48h后开始，每隔24h观察，是否出现附录A中所描述的症状。结果判定对于有典型症状植株样品，分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出兰花细菌性褐腐病菌。无症状植株样品，分子生物学检测结果阳性，且分离培养鉴定或Biolog鉴定为阳性，可判定检出兰花细菌性褐腐病菌。样品及检测结果保存样品及菌种保存样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出兰花细菌性褐腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。从检测样品中分离并鉴定为兰花细菌性褐腐病菌的菌株，应妥善保存。可采用甘油冷冻保存或冻干保存。对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。结果记录与资料保存完整的实验记录应包括：样品来源、种类、时间，检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员的签字。现场检疫发现的可疑症状、培养基上的菌落特征和人工接种的典型症状等应及时拍照保存，PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。

（资料性附录）

兰花细菌性褐腐病菌相关资料症状病菌主要侵染植株或叶片，病菌若在叶片中部为害则形成卵圆形水淹状黄色斑点，后转褐色；若从叶生长点侵入则地上部干缩枯死。感染初期在叶上出现软的、水渍状的小斑点，继而发展成轮廓清晰的、褐色或黑色的凹陷斑点，淡褐色油浸状，并扩展到茎和生长点（见图1）。在蝶兰中，此斑点为水疱状，扩展并联合成片，外围具黄色或浅绿色的晕圈；在兜兰中，则斑点呈水渍状而柔软。此病发展迅速，会使整个植株死亡。高温高湿条件下易发病，相对湿度高于80%时，发病重。E.cypripedii在大花惠兰叶片中部为害症状E.cypripedii接种蝴蝶兰幼苗的为害症状地理分布南非、日本、X大利亚、美国、中国XX、韩国。寄主植物仙人指甲兰（Aeridisjaponium）、杓兰属（Cypripediumspp.）、兜兰属（Paphiopedilum）、蝶兰属（phalaenopsis）和番木瓜（Caricapapaya）、大花蕙兰（Cymbidium）等。病原菌形态及理化特征病原菌菌体杆状，两端钝圆，大小为（0.5～1）μmx（1～3）μm，周生鞭毛。为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，最适生长温度为27℃～30℃，37℃能生长，氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性，能利用海藻糖、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖、不能从乳糖、棉子糖产酸，不能液化明胶，不产生吲哚，不产3-羟基丁酮。病原菌在NA培养基上单菌落表现为淡黄色、圆形、表面突起、边缘整齐，光滑不透明。Erwinia属内在兰花上引起腐烂症状的细菌共有三个近似种，分别是E.cypripedii、E.chrysanthemi、E.carotovora，三个近似种的理化特征比较见表A.1。E.cypripedii、E.chrysanthemi、E.carotovora三个种的理化特征比较测试项目Erwinia属内三个近似种E.cypripediiE.chrysanthemiE.carotovora革兰氏染色（24h）吲哚产生-+-半固体X脂-++苯基丙氨酸脱氨酶（24h）+--明胶水解（22℃）-++己六醇乳糖-d+麦芽糖+-d棉子糖-++海藻糖+-+脂肪酶-+-接触酶反应（24h）+++-：0%～10%阳性；d：26%～75%阳性；+：90%～100%阳性

（规范性附录）

兰花细菌性褐腐病菌PCR特异性扩增检测方法检测引物EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3'EcNP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'PCR反应体系及条件25μLPCR反应体系：2×PCR预混液12.5μL，引物10μmol/L各1μL，DNA模板2.0μL，补充超纯水至25μL。PCR反应条件：98℃/2min；98℃，10s；59.4℃，10s；72℃，10s，35个循环；延伸：72℃/3min；4℃保存。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。X脂糖凝胶电泳PCR扩增产物在1.5%X脂糖凝胶上进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的DNA条带，并拍摄记录。扩增产物片段大小为420bp。结果判断PCR扩增产物在1.5%X脂糖凝胶上进行电泳检测。待测样品、阳性对照均出现约420bp条带、而阴性对照和空白对照均未出现相应条带，PCR扩增结果判定为阳性；待测样品、阴性对照和空白对照均未出现420bp条带，仅阳性对照出现420bp条带，PCR扩增结果判定为阴性。参 考 文 献[1]任欣正.植物病原细菌的分类和鉴定[M].XX：中国农业出版社，1994.[2]MałgorzataWaleron，KrzysztofWaleron，AnnaJ.PodhajskaandEwaŁojkowska.GenotypingofbacteriabelongingtotheformerErwiniagenusbyPCR-RFLPanalysisofarecAgenefragment.PrintedinGreatBritain[J].Microbiology，2002，148:583–595.[3]S.Alab，T.Naglic，M.Tusek-Znidaric，M.Peterkac，M.RavnikaracandT.Dreoac*.PutativenewspeciesofthegenusDickeyaasmajorsoftrotpathogensinPhalaenopsisorchidproduction[J].PlantPathology，2017，66:1357–1368.[4]Cating，R.A