1-药物毒理学-急性毒性和局部毒性-yao

急性毒性和局部毒性

AcuteToxicityandLocalToxicity

北京大学医学部毒理学系

姚碧云

Tel:82801531email:yaoby@

药物治病毒性药理学(Pharmacology)物毒理学

(DrugToxicology)合理安全用药药物发现及研发全过程CELO：先导化合物优先CE：候选药物评价CS：候选药物选择FHD：首次用于人PD：产品决策靶标确认发现阶段非临床阶段临床阶段Ⅱ期Ⅰ期Ⅲ期投放市场

Ⅳ期从药物发现到投放市场均要进行药物毒理研究6~15年CSFHDPDsubmissionLO一般毒性试验特殊毒性试验急性毒性（单次给药毒性）试验局部毒性试验致癌、致畸、致突变生殖、发育毒性靶器官毒性长期毒性（重复给药毒性）试验药物非临床安全性评价

急性毒性通常为毒理学研究的最初步的资料包括经口、吸入、经皮和其它途径的急性毒性，研究急性毒效应表现、剂量-反应关系、靶器官和可逆性。第一节

急性毒性和急性毒性试验

AcuteToxicityandAcuteToxicityTest药物的毒性研究是新药临床前安全性评价的重要组成部分；通过一般毒性研究发现毒作用的表现和靶器官;为进一步毒性机制和探索解毒药物的研究提供线索。

急性毒性(AcuteToxicity)/单次给药毒性（SingledoseToxicity）:

实验动物一次或24小时内多次接受某一药物所引起的毒性效应，甚至死亡。一、概念：

实验动物接受药物的方式或途径不同“一次”的含义也有所不同经口和注射途径，“一次”是指在瞬间给与试验动物染毒。经呼吸道吸入与经皮肤给药，“一次”是指在一个规定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程

“多次”的含义是指当药物毒性很低时，即使一次给予实验动物最大染毒容量还观察不到毒性作用，便需要在24小时内多次染毒，以达到规定的限制剂量。

急性毒性试验(Acutetoxicitytest)

急性毒性试验可以分为两类：以死亡为终点：以检测受试物急性毒性上限指标,

主要是求得半数致死剂量或浓度LD50/LC50

或近似

LD50。非致死性急性毒性为终点：检测非致死性指标,可得到急性毒性LOAEL和NOAEL。

★

LD50：引起实验动物死亡一半时的剂量。

★

LOAEL(LowestObservedAdverseEffectLevel)

观察到有害作用的最低水平水平，在规定的暴露条件下，通过试验和观察，受试物引起机体形态、功能、生长、发育或者寿命某种有害改变的最低剂量或者浓度。★

NOANEL(NoObservedAdverseEffectLevel)：

未观察到有害作用水平，在规定的暴露条件下，通过试验和观察，受试物未引起机体形态、功能、生长、发育或者寿命某种有害改变的最低剂量或者浓度。●评价受试药物急性毒性的大小，了解药物的治疗指数、安全系数，获得毒效应的特征和剂量-反应（效应）关系，获得受试药物的LD50值。●为长期毒性研究及其它毒理试验接触剂量的设计和观察指标选择提供依据。●为受试药物的毒作用机制研究提供参考。二、急性毒性试验的目的三、经典急性致死性毒性试验要点

（一）实验动物的选择和处置

（二）试验设计

（三）毒性症状观察

（四）病理检查

（五）LD50的计算

（六）意义和局限性选择对受试物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。动物易于获得品系纯化价格较低和易于饲养等条件。

（一）实验动物的选择和处置：经典急性致死性毒性试验原则：经典急性致死性毒性试验

体重范围是；大鼠180～240g，小鼠18～25g，狗10~15kg，试验

动物体重变异不应超过平均体重的20％.物种和品系：年龄、体重：

一般常用大、小鼠和狗进行急性毒性实验，首选大、小鼠；

用大、小鼠进行致死性毒性测LD50；利用狗观察毒性反应。

通常雌雄各半。性别:（一）实验动物的选择和处置：

总的原则是应尽可能模拟人可能的给药途径，灌胃给药应注意禁食，灌胃后继续禁食2~4小时。经典急性致死性毒性试验动物检疫：染毒途径：

通常情况下观察5—7天动物分组：

根据实验设计随机分组,至少设3个剂量组,一般设5~7个剂量

组，每组8~10只动物

了解受试药物的理化特性：化学结构、分子量，溶解度、生产批号、纯度、杂质成分与含量等根据受试药物的试验规范要求，决定试验设计和LD50

计算方法。剂量的设计:

查阅化学结构和性质类似药物的毒性资料作为参考

总的原则：用少量动物，以较大的剂量间隔进行预实验，获得10~90%的致死剂量范围，然后在这个剂量范围内以合适的间距设几个（至少3个）剂量组。（二）实验设计：经典急性致死性毒性试验

详细观察和记录实验动物的中毒体征、发生时间、体征发展的过程、死亡前特征等。有助于了解该受试物的靶器官并可能为中毒机制提供线索。实验动物的体重变化：给药前、后和死亡时测体重.非致死性指标的可逆性。（三）观察：经典急性致死性毒性试验给药后一般要求观察14天啮齿类急性毒性试验中常见的体征和观察

给药后，动物往往出现兴奋抑制死亡，或者抑制死亡的现象。

系统和器官中毒后常见的表现中枢神经系统与神经肌肉系统

体位异常，叫声异常，活动增多和呆卧少动．肌颤，痉挛，抽搐，麻痹．后肢无力，运动失调，管状尾，对外界刺激反应过敏或迟钝．植物神经系统

瞳孔扩大，流涎，流泪，出汗．呼吸系统

鼻孔溢液．鼻翼扇动，呼吸深缓，呼吸过速，张口或腹式呼吸．泌尿生殖系统

会阴部污秽，有分泌物，阴户或乳腺肿胀。阴茎突出．遗精．皮肤和背毛

皮肤充血，紫绀，背毛蓬松，污秽．眼睛

眼球突出，充血，角膜混浊，血性分泌物．经典急性致死性毒性试验

（四）病理学检查死亡动物应及时进行大体解剖及病理检查。试验结束时，将存活动物处死，亦应进行大体解剖。大体解剖发现病变的组织器官应作病理检查。经典急性致死性毒性试验（五）LD50（LC50）的计算原理：◀急性毒性的剂量-反应关系曲线模式图

求出回归方程:Y=a+bX。

X为剂量对数值，Y为死亡率的概率单位。利用此式即可求出受试化学物的LD50及其

95%可信区间。

受试物A、B、C剂量反应关系曲线的斜率相同，而LD50A>B>C，因此，急性毒性大小的次序为：C＞B>A。化学物D的LD50与C相同。但斜率比C大，可见在低于LD50的剂量时急性毒性C＞D。

▲4种不同受试物的LD50及剂量/反应

(死亡)关系曲线

利用LD50比较不同受试物的急性毒性LD50是经统计学计算而得到的毒性参数，并报告其95%可信限，较少受实验动物个体易感性差异的影响，因而是最重要的急性毒性参数。经典急性致死性毒性试验（六）LD50试验的意义

标准化药物毒作用强度，评价药物对机体毒性的大小，比较不同药物毒性的大小。计算药物的治疗指数，药效学剂量和毒性剂量的距离。为后续的重复给药毒理试验剂量选择提供参考。通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息。试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体征，为临床毒副反应监测提供参考。

LD50值给予的有效信息少，作用有限。LD50值不能等同于急性毒性，死亡仅仅是评价急性毒性的许多观察终点之一。化学物单次大剂量急性中毒，动物多死于中枢神经系统及心血管功能障碍，并不能很好地显示出各自的毒作用特征和靶器官的病变。（六）急性毒性试验存在的局限性

LD50的波动性很大,LD50没有稳定的数值。EU的80个实验室测定5种化学物的LD50，差别可达2.44～8.38倍化合物范围（mg/kg）比值（最大值/最小值）五氯酚74~620*8.38水杨酸钠930~23282.50苯胺479~11692.44乙酰苯胺723~30604.23氯化镉105~4824.59经典急性致死性毒性试验

急性毒性试验所用的剂量与临床人用剂量差别很大。不能期望使用急性毒性试验的结果来拟定人的临床剂量。物种差异对LD50的影响大。人和动物对药物的敏感性差别很大，如人和小鼠的致死剂量相差很大。16种化学药品的人致死剂量小于小鼠LD50值的1／10。消耗的动物数量大。经典法一次需30-70只动物急性毒性试验存在的局限性

ICH（人用药物注册技术要求国际协调会）LD50的结论在北美、欧洲和日本，“经典”的LD50测定已不再是单剂量毒性试验的正式要求。申报资料要求建议进行逐渐增加剂量的耐受性研究，以监测不同剂量下的毒性反应。建议采用两种哺乳动物。可以用两种啮齿类动物或一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物的严格设计的、单次给药的、逐渐增加剂量的耐受性研究，取代啮齿类动物或非啮齿类动物LD50测定的要求。如果相关的话，ICH建议应用药理学上相关的主要代谢产物应进行单次给药的毒性研究。ICH规定在新药的报批材料中，不必准确的测定LD50，只需了解其近似致死量和详细观察记录中毒表现即可。第二节

急性毒性替代试验

AlternativeMethodsfor

AcuteToxicity

一、固定剂量法（fixeddoseprocedure）二、上、下移动法（up/downmethod）三、限量试验（limittest）

固定剂量法（fixeddoseprocedure）

OECD，1992，2001。不以动物死亡作为观察终点剂量（mg/kg）试验结果（10只动物，大鼠，雌雄各半）存活数100%100%存活，毒性表现明显100%存活，无明显中毒表现5.0高毒，LD5025mg/kg有毒用50mg/kg试验50.0有毒或高毒用5mg/kg试验有害LD50200-2000mg/kg用500mg/kg试验500.0有毒或有害用50mg/kg试验LD502000mg/kg用2000mg/kg试验2000.0用500mg/kg试验该化学物无严重急性中毒的危险性上、下移动法（up/downmethod）

OECD，1998，2001。以死亡为终点动物：大鼠，6~9只剂量：根据最初的资料确定第1只动物的染毒剂量，由第1只动物染毒后的反应决定第2个动物的染毒剂量，每次间隔24h的顺序给每只动物染毒一次，观察：14天上-下法（up/downmethod）限量试验（Limittest）

动物：大鼠或小鼠10~20只，雌雄各半。剂量：单次染毒剂量≤5g/kg体重（食品毒理学，≤15g/kg体重）结论：

无死亡，最小致死剂量MLD＞该限量死亡动物数＜

50%，LD50＞限量死亡动物数＞50%，重新设计，进行常规的急性毒性试验局部毒性为受试物对机体接触部位的毒效应，不包括经接触部位的吸收而引起的系统毒性。局部毒作用的研究可以是受试物剂量与局部毒作用的剂量-反应研究，但对于产品的安全性评价，经常是固定剂量以研究时间-效应关系。

局部毒性又称耐受性试验第三节局部毒性试验LocalToxicityTest皮肤原发性刺激试验（skinprimaryirritationtest）包括单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。观察终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。

皮肤刺激（dermalirritation）是指其皮肤接触化学物后产生的局部可逆性的炎症变化。皮肤腐蚀（dermalcorrosion）是指其皮肤接触化学物后产生的局部不可逆性组织损伤一、皮肤原发性刺激试验方法：脱毛：试验前24小时，机械或化学法脱毛，不可损伤表皮，去毛范围各约3cm×3cm。染毒：取受试物0.5ml(或0.5g)直接涂在皮肤上，然后用纱布及玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定，敷用时间为４小时试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物，在一只家兔或豚鼠背部脊柱两侧可各准备3个去毛区，可进行剂量-反应研究，或测试多种受试物。观察：涂抹部位于染毒后1、24、48小时观察皮肤反应。皮肤反应：红斑，水肿。按其严重程度评分。Draize试验动物：健康、皮肤无损伤的白色家兔、豚鼠。至少4只皮肤原发性刺激试验

反应

分值反应分值

红斑

水肿无红斑0无水肿0略见红斑1稍有水肿1中度红斑2明显可见(边缘高出皮肤)2严重红斑3皮肤隆起水肿轮廓清晰3紫色红斑并有焦痂形成4水中隆起＞1mm4

总分8皮肤刺激反应评分皮肤原发性刺激试验二、眼原发性刺激试验眼原发性刺激试验（eyeprimaryirritationtest）包括单次和多次眼刺激试验等。观察终点:眼刺激和眼腐蚀。眼刺激性（eyeirritation）：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎性变化。眼腐蚀性（eyecorrosion）：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛不可逆性组织损伤。动物：健康家兔，至少4只方法：

0.1ml受试物滴入每只兔的一只眼睛，另一只做为