检测原理和问题处理详解演示文稿

检测原理和问题处理详解演示文稿当前第1页\共有52页\编于星期三\3点优选检测原理和问题处理当前第2页\共有52页\编于星期三\3点★实时荧光定量PCR检测技术

（Real-timePCR)

定量PCR的数学原理

定量PCR的化学原理

定量PCR的光学原理当前第3页\共有52页\编于星期三\3点什么是PCR？

当前第4页\共有52页\编于星期三\3点PCR的反应过程当前第5页\共有52页\编于星期三\3点RT-PCR原理图当前第6页\共有52页\编于星期三\3点荧光定量PCR的数学原理1、Baseline(基线)2、Threshold(阈值)3、ThresholdCycle(CT值)4、[DNA]0(初始模板)Threshold(阈值)[DNA]0(初始模板)ThresholdCycle(CT值)Baseline基线当前第7页\共有52页\编于星期三\3点基线

反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15cycles的信号值线性图谱对数图谱当前第8页\共有52页\编于星期三\3点阈值阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。

当前第9页\共有52页\编于星期三\3点Ct值

扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。当前第10页\共有52页\编于星期三\3点[DNA]0确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量当前第11页\共有52页\编于星期三\3点Real-timePCR动力学曲线和四个阶段

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

PCR理论方程只在指数期成立。当前第12页\共有52页\编于星期三\3点PCR产物的量与扩增循环数间的

理论方程Rn=RB+X0(1+e)nRs

Rn:第N次PCR循环时的荧光信号强度RB:背景信号强度X0(1+e)nRs:每个分子的荧光强度与分子数目的乘积

经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：得到：Ct=klgX0+b线性方程，lgX0

越大，则CT值越小！当前第13页\共有52页\编于星期三\3点

从荧光信号实现定量结果

一、检测荧光信号增长，获取样品CT值当前第14页\共有52页\编于星期三\3点

从荧光信号实现定量结果

二、绘制标准曲线当前第15页\共有52页\编于星期三\3点

从荧光信号实现定量结果

三、以待测样品的Ct值对[DNA]0作图，得到定量结果当前第16页\共有52页\编于星期三\3点

定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理

定量PCR的光学原理当前第17页\共有52页\编于星期三\3点常用的荧光标记方法1、DNA双链特异性染料

SYBRGreen

、SYTO9、LCGreen、Evagreen2、序列特异性探针TaqMan、MolecularBeacons（分子信标）、DualProbes(FRET)、LNA(LockedNucleicAcid)Double-Dyeprobes当前第18页\共有52页\编于星期三\3点SYBRGreenI

工作原理1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2、染料一结合，就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比当前第19页\共有52页\编于星期三\3点SYBRGreenI工作原理图片演示当前第20页\共有52页\编于星期三\3点熔解曲线(Dissociationcurve)目的：在PCR之后分析产物特异性基本程序：-解链；-复性；-升温检测；-降温；软件自动分析当前第21页\共有52页\编于星期三\3点融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Tm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对融解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即Tm当前第22页\共有52页\编于星期三\3点融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。原始图谱导数图谱只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。当前第23页\共有52页\编于星期三\3点SYBRGreenI的优缺点成本低不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜适合初步筛查先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体特异性问题不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号多重定量问题每个PCR管只能检测一个目标基因当前第24页\共有52页\编于星期三\3点Taqman原理Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。当前第25页\共有52页\编于星期三\3点TaqMan探针的作用机理当前第26页\共有52页\编于星期三\3点Taqman探针优点灵敏、特异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响

缺点探针设计有一定难度，需要验证效果探针合成质量对试验结果有较大影响荧光标记成本较高当前第27页\共有52页\编于星期三\3点多重检测原理

同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的荧光报告基团标记不同的探针目的

提高效率，节省时间降低研究成本特点

一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因要保证信号之间互不干扰当前第28页\共有52页\编于星期三\3点常用的荧光染料当前第29页\共有52页\编于星期三\3点DyeExcitationMaxima(nm)EmissionMaxima(nm)FAM495520SGI497522TET521540VIC530552JOE526552HEX540557CY3552570TAMRA552578ROX585605TexasRed595615CY5643667当前第30页\共有52页\编于星期三\3点

定量PCR的数学原理

定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理当前第31页\共有52页\编于星期三\3点当前第32页\共有52页\编于星期三\3点当前第33页\共有52页\编于星期三\3点荧光PCR区别于其他PCR方法主要

有以下优点

1)全封闭反应，无需PCR后处理

2)特异性强，灵敏度高

3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确

4)定量范围宽，可达到10个数量级

5)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断

6)可实现一管双检或多检

7)操作安全，缩短时间，提高效率

8)利于自动化和联网管理当前第34页\共有52页\编于星期三\3点

定量PCR常见问题处理当前第35页\共有52页\编于星期三\3点扩增曲线-AmplificationPlot

当前第36页\共有52页\编于星期三\3点标准曲线-StandardCurve

当前第37页\共有52页\编于星期三\3点原始数据-Component

当前第38页\共有52页\编于星期三\3点各波长的原始信号-Spectra

当前第39页\共有52页\编于星期三\3点融解曲线-Dissociation

当前第40页\共有52页\编于星期三\3点定量PCR实验中的10个常见缺陷1.引物或探针的设计不过关2.RNA模板质量差3.没有使用“预混液”，导致差异的累积4.发生污染5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰6.选取了不恰当的“内参基因”7.在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”8.没有正确设置“基线”和“阈值线”9.反应体系“扩增效率”低下10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化当前第41页\共有52页\编于星期三\3点导致异常实验数据的常见原因错误的荧光染料设置错误的反应程序设置荧光污染反应试剂质量问题仪器硬件问题未正确密封而导致的试剂蒸发当前第42页\共有52页\编于星期三\3点实例1：没有标准曲线标准品没有填写相应的数值当前第43页\共有52页\编于星期三\3点实例2：没有扩增曲线原因1：PCR参数设置错误−数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。当前第44页\共有52页\编于星期三\3点实例2：没有扩增曲线原因2：硬盘休眠，数据采集中断当前第45页\共有52页\编于星期三\3点实例3：基线下滑从原始数据找原因−1-9循环，ROX的信号下降−基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；−应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。当前第46页\共有52页\编于星期三\3点实例3：基线下滑修改基线范围为10-20，重新分析当前第47页\共有52页\编于星期三\3点实例3：基线下滑基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱当前第48页\共有52页\编于星期三\3点实例4：扩增曲线弯曲

原因：基线设置的终点大于样品CT值。通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值<15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。

解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。当前第49页\共有52页\编于星期三\3点实例4：扩增曲线弯曲原因：样品浓