不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第一页，共十一页，编辑于2023年，星期六实验原理电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。泳动的速度取决于粒子带电的多少、分子的大小和形状聚丙烯酰胺凝胶电泳：被电泳的物质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形成不连续的圆盘形区带。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用。第二页，共十一页，编辑于2023年，星期六不连续体系：凝胶孔径大小不连续缓冲溶液成分和pH不连续电场中形成电位梯度不连续样品在浓缩胶中，浓缩成很薄的区带，通过3个物理效应，进行电泳分离。3个物理效应：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应实验原理小分子蛋白质在前，大分子蛋白质在后电荷多蛋白质在前，电荷少蛋白质在后第三页，共十一页，编辑于2023年，星期六操作步骤一、制备凝胶玻管直径0.6cm，长10cm。底部用白色胶塞封口，中间用绿色胶塞固定1.分离胶：过硫酸铵-TEMED系统，化学聚合依次加入A:C:H:G20mL→轻搅匀→

24410mL沿管壁滴入封顶液X3滴→15-20分成胶

→甩去封顶掖(底部~绿胶塞顶部7cm）沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度→第四页，共十一页，编辑于2023年，星期六2.浓缩胶：核黄素-TEMED系统，光聚合依次加入B:D:E:F8mL→轻搅匀→1cm/管1214mL→封顶液X3滴→垂直放入圆盘电泳仪孔中→紫外线照射5-10分成胶→甩去封顶掖电极缓冲液浓缩胶1cm分离胶7cm操作步骤样品

绿色胶塞上电泳槽下电泳槽电极缓冲液第五页，共十一页，编辑于2023年，星期六二、安装凝胶管

1.去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装注意：不能漏水，上槽先加少许缓冲液M检漏三、加样样品处理：血清(生理盐水稀释)+甘油+溴酚蓝加样：微量加样器沿壁加样100微升操作步骤

2.电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽在电泳仪上槽小孔内,塞紧绿胶塞。中的电极及小玻管的下端第六页，共十一页，编辑于2023年，星期六操作步骤四、加电极缓冲液1.玻管凝胶样品上方，电极缓冲液M沿壁缓慢2.上槽加电极缓冲液M浸没玻管顶部及加入，封满玻管圆盘电泳仪盖上的电极第七页，共十一页，编辑于2023年，星期六操作步骤五、通电电泳时间1小时→绿胶塞下出现染料蓝色带→关电泳仪开关→拔电源插头→取下电极线→取玻管→倒去上槽中的缓冲液通直流电.恒流接电极线红A黑红B黑+-下槽

上槽电压180-400v（自动，不用调）3mA/管，3×12管=36mA3×24管=72mA

一拖二600v

100mA

恒流

开推进

推进

不推

推进调整调整mA→36mA/72mA电泳仪第八页，共十一页，编辑于2023年，星期六六、固定、染色、脱色（集中进行）长针头沿玻管壁插入凝胶中旋转打入下槽中的缓冲液，将凝胶滑入烧杯中固定：在培养皿中，用固定液N固定5-10分操作步骤染色：倒去固定液，用染色液O染色30秒脱色：倒去染色液→自来水冲洗→洗脱液P漂洗3-4次→底色浅，区带清晰无色透明凝胶→乳白色蛋白质带、染料的蓝色带胶全黑胶蓝色、蛋白质蓝黑色带第九页，共十一页，编辑于2023年，星期六结果分析一、浓缩胶中的浓缩效应二、分离胶中的蛋白质分离第十页，共十一页，编辑于2023年，星期六注意事项1.制备凝胶的高度，可用绿色胶塞固定位置2.固定、染色、脱色：集中进行3.每台共用：分离胶20mL、浓缩