单细胞转录组基本概念瑞客

单细胞转录组基本概念易生信，毕生缘；培训。易生信(

)——最懂你的生信培训，学习生信更容易易生信，毕生缘；培训。易生信2单细胞转录组与群体转录组什么不同？单细胞转录组的操作流程3易生信单细胞转录组测序技术的发展4易生信易生信单细胞转录组的关键步骤单细胞分离和捕获

转录本的捕获和扩增RNA测序需要0.1-1.0ugtotal

RNA单细胞里面有1-50

pgRNA，捕获效率10%DNA测序需要1

ng

DNA易生信，毕生缘；培训。6单细胞分离和捕获易生信

易生信，毕生缘；培训

。

7易生信单细胞分离和捕获–微孔易生信，毕生缘；培训。8微孔：先用移液管或者激光切割或FACS的方式分离细胞并放到微孔中。适合有目的细胞集或细胞量很少的情况。易生信单细胞分离和捕获–微流微流型平台，比如Fluidigm’s C1，提供了一个更加整合的系统，同时可以捕获细胞和完成文库构建的准备过程。比微孔型平台通量更高只能捕获10%的细胞，不适合处理稀有细胞或细胞量量很少的情况。易生信，毕生缘；培训。9(17)30049-7易生信单细胞分离和捕获–液滴易生信，毕生缘；培训

。

10液滴型方法是将单独的细胞和一个包含建库所需酶的珠粒(bead)包裹在一个纳米级液滴里面。特殊地，每个珠粒(bead)包含一段独特的条形码序列(barcode)，会加到所有来自于液滴里面这个细胞的序列上，用于区分不同细胞的转录本。(17)30049-7易生信，毕生缘；培训。易生信11单细胞分离和捕获–液滴易生信单细胞分离和捕获–Microwell细胞悬液加到凝胶微孔模具上，利用重力使细胞落入微孔，通常一个微孔只能容纳一个细胞，一块板子可以同时捕获约10000个单细胞。每一步操作都可视、可控制，doublets可以通过镜检洗除。随后每个孔加入包含107-8特定探针集的与孔径大小匹配的磁珠，标记每个细胞中的mRNA。易生信，毕生缘；培训。12易生信易生信，毕生缘；培训。13单细胞分离和捕获–Magnetic

beadCellnumber/ExperimentExperimentscaleupGenenumberLibrarycost($)Equipmentcost($)Microwell-seq5000-10000Twolargearrays(4Xareas)atthesametime500-50000.02Template:0.1KDrop-seq5000-10000Installmultiplepumpsystems500-50000.1Pumps:5KMARS-seq384-1536Difficult500-50001.3Around400K10XGenomics5000-10000Run8channelsinoneexperiment1000-60000.5Around100KC1-HT600-800Difficult3000-70005Around400K易生信，毕生缘；培训。14易生信不同单细胞捕获方法的成本比较易生信156个常用scRNA-seq实验方法易生信易生信，毕生缘；培训。16单细胞转录组用到的3种序列–cell

barcodeCell

barcode: 10-41 bp，来源于一个细胞的转录本理论上都有相同的call

barcode。不同的barcode代表来源于不同的细胞。易生信易生信，毕生缘；培训。17单细胞转录组用到的3种序列-UMIUMI(unique

molecular

identifier):

反转录过程中添加到转录本上的4-10bp的随机条形码序列，使得测序reads可以对应到单个转录本，去除扩增噪声和偏好性。ERCC

spike-in:易生信易生信，毕生缘；培训。18单细胞转录组用到的3种序列-UMI因为UMI的序列种类远少于细胞中RNA分子数，每个UMI条形码可能会连接到多个转录本，需要借助条形码序列和reads比对位置两个条件鉴定起始的转录本分子。易生信易生信，毕生缘；培训。19单细胞转录组用到的3种序列–spike-inERCC

spike-in:

External

RNA

Control

Consortium，92 poly-A

transcript,

length 250-2000

nt,

GCcontent

5-51%.可以与细胞RNA混合，一起测序，作为阴性对照，评估技术噪音。但使用时需谨慎，其特性与内源

RNA毕竟不同，直接用于标准化需要多加注意。真实转录本拷贝数鉴定易生信20易生信，毕生缘；培训。易生信21检测到的基因数和准确性的比较10.1016/j.molcel.2017.01.023

测序饱和度比较22易生信易生信，毕生缘；培训

。

10.1016/j.molcel.2017.01.023

更多方法的准确性和敏感性比较23易生信易生信24易生信，毕生缘；培训。液滴型单细胞测序技术的比较易生信25易生信，毕生缘；培训。液滴型单细胞测序技术的比较易生信26易生信，毕生缘；培训。捕获效率：10X可用细胞比例最高，近50%易生信27易生信，毕生缘；培训。图示Cell

barcode

和UMI的使用易生信可捕获的细胞的数目理论值：万-百万级易生信，毕生缘；培训。The

effective

barcode

size

is

5x104

for

inDropandat

least

1x106for

Drop-seq

and

3x105

for10X.10X有最少的cell

barcode错配。鉴定含有细胞的液滴–文库大小拐点法29scRNA-seq方法中只有一小部分的液滴包含珠状物和一个完整细胞。然而生物实验不会那么理想，有些RNA会从死细胞或破损细胞中漏出来。所以没有完易生信鉴定含有细胞的液滴–文库大小拐点法30易生信易生信10X和inDrop拐点更明显易生信，毕生缘；培训。大多数方法使用每个barcode对应的总分子数(如果是UMI)或总reads数的分布来寻找一个“break

point”区分来自于真实细胞的较大的文库和来自于背景的较小的文库。易生信34易生信，毕生缘；培训。10X检测到的基因数目相对多易生信35易生信，毕生缘；培训。10X有最高的有效reads比例易生信36易生信，毕生缘；培训。10X有最高的检测敏感性和稳定性易生信37易生信，毕生缘；培训。10X具有最低的技术噪音测序饱和度评估易生信，毕生缘；培训。38易生信所有3个方法都可以在少于10

K

reads时检测超过1000

UMI。10X在20

K reads时可以检测1万UMI，而Drop-seq需要50

K

reads，InDrop却只能检测3k

UMI。10X需要200

K reads接近饱和，Drop-seq需要80

K

reads，inDrop需要60

K

reads。基因数目比转录本数目（uMI数）更容易达到饱和。20

K有效reads，准确性达到饱和。易生信易生信，毕生缘；培训。39Drop-基于的技术评估结果总结商业系统10X稳定性、准确性、敏感性最好，技术噪音最小，但费用也最高。($50,000+$0.5/cell)Drop-seq敏感性和准确性弱一些，但价格也便宜些，适用于大量细胞。($30,000+$0.1/cell)inDrop完全开源版本的10X，但试剂和步骤还有优化的潜力，适用于非标准的技术开发。($50,000

+$0.25/cell)10

X

Genomics

技术易生信，毕生缘；培训。10X

单细胞操作流程41易生信10X流程42易生信，毕生缘；培训。易生信10X

beads

and

oligos43易生信10X

微流控芯片8通道适用于大量细胞44易生信10

X

GEM内序列捕获、反转、模板转换45易生信裂解GEMs释放标记好的cDNA46易生信所有细胞cDNA一起PCR扩增47易生信10X测序获得的reads，barcode+转录本48易生信10X测序深度：每个细胞至少2万条reads49易生信Cellranger分析流程50易生信同一个样品，同一个文库适用count52易生信多个文库适用count+aggr53易生信易生信10X样品准备注意事项完全解离的单细胞悬液，最小化细胞聚集、非细胞核酸和反转抑制因子细胞悬液包含多于90%的有活力细胞，避免细胞受损或死亡产生过多游离RNA操作温柔加载细胞浓度在700-1200

cells/ul，总量在500-10,000细胞。易生信，毕生缘；培训。55评估需要测序的细胞数56易生信scRNA-seq测序分析流程总览58易生信易生信单细胞转录组的局限性微操作分离细胞依赖于特殊设备或劳力需求多；酶处理细胞形成悬液影响细胞活力和转录状态细胞原始的空间信息和所处的环节丢失每个细胞只能捕获大约10%的转录本，难以检测低丰度转录本只能检测poly-A的RNA59易生信，毕