保健功效及检测方法

一、多糖的检测方法（1）粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法（2）葡聚糖的分光光度测定法（3）硫酸软骨素的分光光度测定法二、皂苷类化合物的检测方法（1）总皂苷的分光光度测定法（2）绞股蓝皂苷的分光度测定法三、黄酮及苷类化合物的检测方法（1）总黄酮的风光光度测定法（2）原花青素的分光光度测定法（3）原花青素的铁盐催化比色测定法四、酶、激素及内源性物质的检测方法（1）超氧化物歧化酶的氮蓝四唑测定法（2）超氧化物歧化酶的连苯三酚自氧化测定法（3）氯化高铁血红素的分光光度测定法五、其他类化合物的检测方法（1）总蒽醌的分光光度测定法（2）几丁胺糖的脱乙酰度滴定法（3）总三萜的分光光度测定法六、第一章概论(第3页)表1-1常见的保健食品的功效成分（标志性成分）、保健功能及主要来源功效成分（标志性成分）保健功能主要来源黄酮类银杏黄酮、山楂黄酮辅助降血脂、提高缺氧耐受力、抗氧化、增强免疫力、保护心血管系统、保护脑神经系统银杏叶、山楂、蜂胶、葛根、沙棘、红花、荷叶、甘草、桑叶、陈皮、花粉、桑葚、黄芪、淫羊藿、鱼腥草多糖类灵芝多糖、香菇多糖缓解体力疲劳、增强免疫力、辅助降血糖、辅助降血脂灵芝、香菇、枸杞、银耳、灰树花、人参、西洋参、昆布、木耳、山药、黄芪、茯苓、猪苓、黄精、苦瓜皂苷类红景天苷、人参皂苷缓解体力疲劳、增强免疫力、抗氧化、抗辐射、提高缺氧耐受力、辅助降血糖、保护心血管系统人参、西洋参、红景天、绞股蓝、三七、山药、黄芪、酸枣仁、桔梗、远志、知母、甘草、大豆、蒺藜、太子参蒽醌类通便、美容、减肥、增强免疫力芦荟、大黄、决明子、何首乌花青素抗氧化、增强免疫力、抗辐射、保护心血管系统葡萄子、葡萄皮、越橘、黑加仑、玫瑰茄、甘蓝、桑葚、紫甘薯、茶叶三萜类灵芝三萜、角鲨烯抗氧化、增强免疫力、抗辐射、缓解体力疲劳、辅助降血脂、辅助保护化学性肝损伤、改善睡眠、改善记忆灵芝、赤芝、紫芝（孢子粉）、甘草、黄芪、人参、泽泻、积雪草、山楂、女贞子、苦丁茶、五味子、深海鱼油（金枪鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲑鱼）壳聚糖（几丁聚糖）增强免疫力、辅助降血脂、辅助降血糖、辅助保护骨粘膜虾、蟹壳的提取物硫酸软骨素辅助降血脂、增强免疫力、保护骨关节、参与制造骨骼动物的软骨（第73页）第三章保健食品中功效成分的检测方法第一节多糖的检测方法粗多糖的苯酚—硫酸分光光度测定法方法提要多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，再与苯酚—硫酸作用成橙红色化合物，其呈色度与溶液中的糖的浓度成正比，在485nm波长下比色定量。4、测定步骤样品提取：称取混合均匀的固体样品1.0~2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，与沸水浴中加热1小时（如保健食品添加的已是多糖提取物，则加热15min），冷却至室温后补加水至刻度线（V1）,混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀粗多糖。在这里必须强调的是不少保健品添加了淀粉、糊精，一定要做相应的处理，否则结果偏高。添加淀粉的样品需加α-淀粉酶及糖化酶（如葡萄糖苷酶）处理。添加糊精的样品需加糖化酶（如葡萄糖苷酶）处理。处理的原则是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解成单糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需的活性多糖以达到分离的目的。添加淀粉或淀粉+糊精的样品：可取50mL样品提取液置于100mL具塞锥形瓶中，冷却至60℃以下，加1mL10%淀粉酶液（Singma公司的液状淀粉酶可直接加0.1~0.2mL）和0.5mL0.2M磷酸盐缓冲液，加塞，至55℃~60℃萄糖及2倍量得淀粉、糊精，不影响样品中粗多糖的测定结果。但在测定过程中应避免糖和其他碳水化合物的污染，因为苯酚—硫酸与糖和碳水化合物起反应。某些保健食品中功效成分为醇溶性多糖，可参照本方法进行测定，但样品预处理时将乙醇改为丙酮即可。液体样品中粗多糖含量低时，可取样50.0mL加热浓缩至5.0mL后，再依法操作测定。洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其他糖分和碳水化合物用80%乙醇洗净，否则结果偏高。8、关于保健食品粗多糖测定方法分光光度法的说明多糖因单体组成、结构、聚合度、物化性质等各异，故测定方法不同，此法适用于测定高分子量的糖类物质（>10000Da）多糖的定义是聚合度大于9的糖（第110页）十一、硫酸软骨素的分光光度测定法本方法硫酸软骨素的检出限为0,01mg/L。方法提要结晶紫是一种阳离子染料，在酸性条件下带正电荷，易与带酸性基团的生物大分子发生静电作用而形成离子配合物，已用于脱氧核糖核酸、干扰素等的分光光度法分析。结晶紫结构中的氨基带正电荷，硫酸软骨素的磺酸基和羧基带负电荷，两者通过静电引力和输水作用力形成络合物，产生变色效应，吸光度降低。吸光度的降低量与硫酸软骨素含量线性相关。4、测定步骤（1）样品处理：精密称取内容物25mg，置于100mL量瓶中，加水适量，超声处理10min，加水定容至100mL,过滤，取续滤液4mL,置于100mL量瓶中，加水至刻度，得样品溶液。（2）分光光度法测定：取供试品溶液1mL，置于10mL具塞刻度试管中，加入pH5.0的醋酸—醋酸钠缓冲液1.0mL和结晶紫并粗三溶液0.6mL，加水至10.0mL，摇匀，30℃水浴保温20min,放至室温。以水为参比，于588nm6注释硫酸软骨素是提取于动物软骨的黏多糖类物质，在心血管疾病、关节病的防治等方面具有重要作用。硫酸软骨素除了作为药用品外，大量的是作为改善关节病的补充品，作为健康食品应用，在美国已经风行多年，经过多年的应用，已经证明硫酸软骨素对改善老年退行性关节炎、风湿性关节炎有一定的效果。（第113页）第二节皂苷类化合物的测定方法总皂苷的分光光度测定法方法提要样品中总皂苷经提取、PT—大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷Re为对照品，于560nm处比色测定。4、测定步骤（1）样品处理1）固体样品：称取1.0g左右样品置于100mL烧杯中，加入20~40mL85%乙醇，超声波振荡30min，再定容至50mL,摇匀，放置，吸取上清液1.0mL,挥干后以水溶解残渣，进行柱分离。2)液体样品：含乙醇的酒类样品：准确吸取1.0mL样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析。非乙醇类液体样品：准确吸取1.0mL样品（如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取1.0mL）,直接进行柱分离。（2）柱层析：以PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液1.0mL上柱，用15mL水洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作显色用。（3）显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加入0.8mL高氯酸，混匀后移入10mL比色管中，塞紧盖子，于60℃以下水浴加温15min取出，冷却后准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后以1.0cm比色皿与560nm处与人参皂苷Re（4）标准曲线绘制：人参总皂苷浓度在40~200μg/mL之间与吸光度值呈线性关系，相关系数（r）0.999.6、注释回收率：90%~105%。（第122页）第三节黄酮类及苷类化合物的检测方法总黄酮的分光光度测定法本方法总黄酮检出限为3.5μg/mL。方法提要黄酮类化合物是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有4位羰基，且呈黄色。黄酮类化合物多分布于植物中，大多数以苷的形式存在。黄酮类化合物中的3-羟基、4-羟基或5-羟基或邻二位酚羟基与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。4、测定步骤（1）样品处理1）固体样品：称取1~2g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于平底烧瓶中加入50~100mL70%乙醇溶液，浸润后，在80℃水浴下回流2h，至黄酮类化合物基本提取完全。粗提取液冷却后，减压抽滤，并用少量70%乙醇溶液洗涤残渣，合并滤液。在50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至烧瓶内溶液呈无醇味。倒数烧瓶内溶液，并用30mL热水分3次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液导入分液漏斗中，以75mL氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集下层水溶液并定容至称取1~2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液1~2mL，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70%乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0mL/min,至流出液基本无色，一般收集10mL即可。上述洗出液用洗脱剂（70%乙醇或甲醇）定容后即可用于测定。2）液体样品：准确吸取样品3.0mL，定容至50mL后，直接以75mL氯仿分3次萃取脱脂，其余步骤同上。（2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL（相当于芦丁0μg、75μg、150μg、300μg、450μg、600μg），分别移入10mL刻度比色管中，加入30%乙醇液至5mL,各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入10%硝酸铝溶液0.3mL,摇匀后放置60min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL,用30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1cm的比色皿，在510nm处测定吸光度，绘制芦丁含量（μg）与吸光度的标准曲线。（3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤与510nm处进行吸光度的测定（样品如有沉淀，应过滤后测定）。芦丁浓度在0.0075~0.060mg/mL范围内呈直线关系。6、注释（1）方法精密度：对同一样品在相同条件下，重复测定6次，其相对标准差为4.4%。（2）方法回收率：对总黄酮含量为1.52%的减肥茶加入相似浓度的芦丁标准品进行回收试验，其平均回收率为103.2%。（3）对于以葡萄、山楂等有色水果味原料的样品，可用未加铝盐试剂的样液为空白或采用标准加入法进行测定，以避免样液颜色对测定干扰而引起结果偏高。（第131页）六、原花青素的分光光度测定法本法适用于各种植物组织、器官及其制剂（如葡萄子与松树皮提取物）中原花青素含量的测定。方法提要原花青素（也称缩合单宁）是黄烷—3—醇的寡聚体与多聚体，属多份类化合物。与其他酚类化合物不同，黄烷醇（缩合单宁、单体、双体等）在酸性介质中可与香草醛反应，生成在500nm处有最大吸收的有色物质，可通过比色测其含量。如无提纯的原花青素，可用儿茶素代替4、测定步骤（1）样品中原花青素液的制备：植物材料经4倍体积丙酮+水（7+3，体积比）或者经60%甲醇提取，40℃冰冻干燥的固体原青花素制剂，直接溶于水中（先加少量甲醇助溶），制成原青花素液。原青花素液与5℃（2）样品测定：用锡箔将试管（14mm*120mm）包裹严，仅留试管口用于加样。向管内加入试样0.5mL，再加3.0mL4%香草醛甲醇液混合，然后加入1,5mL浓盐酸，彻底混匀，室温下显色15min，也可在暗环境下进行以上操作。最后在500nm处比色。（0.1mg原花青素在500nm处的吸收值为0,55）6、注释（1）本方法的检测范围为（5~500）*10-3mg/0.5mL样液。精密度与准确度大于1*10-3mg。（2）反应试管应用清洁剂浸泡24小时，彻底洗涤干净。（3）进行比色时，用水作空白对照。（4）500nm处的OD值应控制在3以下。（5）试样中花青素含量较高时，应从香草醛存在下所测A500nm值中减去无香草醛时所测值。（6）显色液应避光放置。（第133页）七、花青素的铁盐催化比色测定法方法提要原花青素氧化后能生成红色的花青素。通常用铁盐催化比色法测定总量，利用硫酸高铁铵的催化作用，以盐（OD550）,与原花青素化学对照品比较，便可定量计算出样品中原花青素的含量。4、测定步骤（1）标准曲线的绘制:分别移取上述不同浓度系列使用液1.00mL置于10mL刻度试管中，加入9mL上述反应混合液，置于沸水与中加热，待水浴温度恢复至（99+1）℃时开始计时，并塞紧塞子（勿摇匀），准确加热40min后，立即取出，用冰水快速冷却至室温，以正丁醇定容至刻度线，塞紧后充分摇匀，在550nm处以空白管调零扣除背景，测定吸光度值OD550，并以最小二乘法绘制原青花素浓度（μg）—吸光值OD550曲线。（2）待测样品液的制备：准确称取胶囊内容物0.5~1.0g，加污水乙醇（遇醇溶性较差的样品，可加入少量的蒸馏水促进溶解），溶解（对于软胶囊取整粒称重后再用小刀割破，用超声波以乙醇多次提取）,定容至100mL,摇匀，即得到样品储备液。再移取0.5~1mL储备液（根据提取物浓度高低确定具体的量，使待测液原花青素浓度在0.05~0.20mg/mL范围内）定容至50mL,摇匀得到待测样品液。（3）样品测定：移取1.00mL待测液依照上述标准曲线绘制同样操作，测定OD550，查标准曲线，并计算原花青素的含量。6注释线性范围：本法原花青素浓度在26.00~416.0μg范围内，最低检出限为4μg。准确性：添加浓度为52.00~208.0μg的标准（OD550在0.157~0.520范围内），3次测定平均回收率在90.64%~109.5%。精密度（重现性）：同一样品液8次测定，相对标准差为2.13%~2.98%。干扰物质：常见的维生素，芦丁、类胡萝卜素、食品抗氧化剂、各类油脂基体未见明显干扰，由于多糖、蛋白质不溶于无水乙醇，故不会干扰测定。（第151页）第四节酶、激素及内源性物质的检测方法七、氯化高铁血红素的分光光度测定法本方法氯化高铁血红素的最低检出浓度为0.15μg/mL。方法提要氯化高铁血红素是以新鲜猪血经冰醋酸法提取加工而成的动物性补铁剂，能被人体黏膜上皮细胞分解为原卟啉及二价铁，从而进入血液被机体吸收和利用。氯化高铁血红素制品以氢氧化钠溶液溶解和定容后，以1cm比色皿于波长385nm处进行检测，与标准品比较进行定量。4、测定步骤（1）样品处理1）固体样品（胶囊或片剂）：准确称取一定量样品，一边研磨，一边加入0.1mol/L氢氧化钠，使氯化高铁血红素充分溶解（注意不能加热溶解，否则引起结果偏高），定容后备检测。2）液体样品：摇匀后准确吸取一定量样品，用0.1mol/L氢氧化钠稀释后待测定。（2）标准曲线绘制：准确称取经105℃干燥至恒重的氯化高铁血红素标准品10.00mg，用0.1mol/L氢氧化钠充分溶解并定容至100mL,容量瓶中。吸取此储备液10mL，加于100mL容量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠定容至刻度，摇匀，配成10μg/mL的标准使用液。分别准确吸取标准使用液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL至10mL比色刻度试管中，加0.1mol/L氢氧化钠至刻度，以零管作空白调零，于385nm处测定吸光度，并绘制氯化高铁血红素含量—氯化高铁血红素浓度在1.2~7.0μg/mL范围内吸光度与浓度呈直线关系（3）样品测定：取上述样品处理液依照标准曲线操作步骤测定385nm处的吸光度值，依据标准曲线查得氯化高铁血红素含量。（第201页）第九节、其他化合物的检测方法四、总蒽醌的分光光度测定法1、方法提要蒽醌类化合物经酸水解用氯仿提取后，再用稀碱液萃取，与1,8二羟基蒽醌对照品比较，在分光光度计530nm处比色定量。4、测定步骤（1）样品处理：准确称取均匀的样品粉末0.5~2g或适量，液体样品可取10mL左右（视含量而定），置于200mL带冷凝管的锥形瓶中，加5mol/L硫酸40mL，加热回流水解2小时，稍冷后加氯仿30mL，水浴加热回流1小时，分离出氯仿液，再加氯仿30mL，加热回流水解30min，分离出氯仿液，再加氯仿20mL，如此反复，提取至氯仿无色位置，收集氯仿提取液过滤，将滤液移至容量瓶中，用氯仿定容至刻度（V1）,摇匀，精密吸取一定量（10mL左右）（V2）置分液漏斗中，用混合碱液（每次5mL）萃取至无色，将萃取液移至50mL量瓶中，用混合碱液调至刻度。6、注释（1）总蒽醌包括游离蒽醌和结合蒽醌，游离蒽醌测定，样品直接用氯仿提取至无色，再用混合碱液多次萃取氯仿提取液制得供试品溶液，而结合蒽醌测定系先用5mol/L的硫酸水解，再用氯仿提取，再用混合碱液多次萃取氯仿提取液质的供试品溶液。（2）本方法线性范围为0.116~0.580mg/mL（3）本方法的平均回收率为97.0%（n=3）。（4）精密度RSD=1.2%（n=5）。（5）比色时注意比色液中是否混有氯仿微粒的干扰，而影响测定结果。（第224页）十四、几丁胺醣的脱乙酰度滴定法方法提要几丁胺醣又称壳聚糖、脱乙酰甲壳素、甲壳胺，由甲壳素在80℃~120℃下经强碱长时间脱去乙酰基而得到，化学名称为（1,4）-2-氨基-2-脱氧-β4、测定步骤准确称取0.25g几丁胺醣样品，置于100mL烧杯中，加入0.1mol/L盐酸40mL，在室温下用平头玻棒捣碎试样，并搅拌使其充分溶解，放置2小时，加一滴0.1%甲基橙作指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定至红色刚好消失，保持1min，计算消耗的氢氧化钠标准溶液的体积。注：平行测定结果不大于0.2%，计算结果精确至小数点后一位。（第231页）十八、总三萜的分光光度测定法本方法适用于灵芝制品（灵芝孢子粉、灵芝孢子油）中总三萜含量测定。方法提要灵芝孢子中含有一百二十多种三萜类化合物，其结构十分复杂，要分离获得高纯度具有代表性的三萜化合物对照品技术难度大，因此，对于总三萜化合物含量的常规测定方法，目前仍以在自然界广泛存在的三萜化合物熊果酸为对照品，以分光光度法测定。由于熊果酸与三萜类化合物的分子结构中均有相似的官能团结构，在特定的显色剂作用下，在548nm处显示相同的吸收特征，本法测得的含量实际为总三萜化