过程中常见问题及处理方法演示文稿

过程中常见问题及处理方法演示文稿当前第1页\共有36页\编于星期一\15点过程中常见问题及处理方法当前第2页\共有36页\编于星期一\15点WB的简介WB即蛋白质印迹法（WesternBlot）。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

当前第3页\共有36页\编于星期一\15点

基本原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。当前第4页\共有36页\编于星期一\15点

应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其它蛋白的互作3.目的蛋白的组织定位4.目的蛋白的表达量分析当前第5页\共有36页\编于星期一\15点当前第6页\共有36页\编于星期一\15点当前第7页\共有36页\编于星期一\15点当前第8页\共有36页\编于星期一\15点三、WB的影响因素步骤较多，任何一步都可能影响结果1、电泳分离蛋白蛋白抽提；蛋白定量；样品制备变性；上样量；电泳（电压、电流的大小，胶浓度、制胶）当前第9页\共有36页\编于星期一\15点2、转膜膜的选择；膜的确认；特殊处理；……当前第10页\共有36页\编于星期一\15点3、封闭封闭液的选择；封闭条件优化；……当前第11页\共有36页\编于星期一\15点4、漂洗漂洗液的配制与选择漂洗时间及次数当前第12页\共有36页\编于星期一\15点5、抗体孵育抗体及稀释液选择；抗体稀释倍数优化；抗体孵育时间；……当前第13页\共有36页\编于星期一\15点6、曝光曝光时间的掌控当前第14页\共有36页\编于星期一\15点四、注意事项1.蛋白样品的提取尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）

选择合适的裂解液准确定量（BSA标准蛋白）

当前第15页\共有36页\编于星期一\15点当前第16页\共有36页\编于星期一\15点2、制胶根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。当前第17页\共有36页\编于星期一\15点

制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净，不能有残留的胶。玻璃板底部放平，尽量不能漏胶灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝水或异丙醇压的时候，不能太久当前第18页\共有36页\编于星期一\15点

3、转膜a泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡20min；

凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化当前第19页\共有36页\编于星期一\15点c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板，不能放反d转膜过程产生大量的热，注意冷却e具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短f避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。当前第20页\共有36页\编于星期一\15点g夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全h保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率i一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景当前第21页\共有36页\编于星期一\15点4、封闭

a脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素

b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂当前第22页\共有36页\编于星期一\15点5、孵育a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效价问题当前第23页\共有36页\编于星期一\15点五、常见问题及解决电泳中的问题︶条带呈笑脸状——凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;——电泳系统温度偏高当前第24页\共有36页\编于星期一\15点︵条带呈皱眉状

可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全当前第25页\共有36页\编于星期一\15点

拖尾样品溶解不好当前第26页\共有36页\编于星期一\15点纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒当前第27页\共有36页\编于星期一\15点条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜当前第28页\共有36页\编于星期一\15点条带两边扩散加样量过多当前第29页\共有36页\编于星期一\15点

Westernblot结果曝光问题

背景过高且不均匀1、封闭不充分——延长封闭时间；——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）

2、一抗浓度过高——增加一抗稀释倍数；

3、抗体孵育温度过高——4℃孵育当前第30页\共有36页\编于星期一\15点4、二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度5、洗膜不充分——增加洗涤次数，增加洗膜次数当前第31页\共有36页\编于星期一\15点没有阳性条带或很弱1、一抗、二抗等不匹配订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性更换更好的一抗二抗当前第32页\共有36页\编于星期一\15点2、一抗或/和二抗浓度低增加抗体浓度；长孵育时间；当前第33页\共有36页\编于星期一\15点3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶）当前第34页\共有36页\编于星期一\15点4、样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少