微生物检验授课讲稿

微生物检验授课讲稿1第一页，共五十五页，编辑于2023年，星期二无菌室的质量管理菌种保存、复壮及管理药品微生物限度检查方法药品微生物检查法的验证2第二页，共五十五页，编辑于2023年，星期二无菌室的管理陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。人员：肥皂洗手，0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，手不能来回出入操作台。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气湿气，用紫外灯杀菌半小时。非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。缓冲间不得放杂物、培养箱等。定期对门、窗、墙面等消毒。定期检查洁净度情况。3第三页，共五十五页，编辑于2023年，星期二通常，实验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应根据试验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动，将交叉污染的风险降低到最低。一般情况下，药品微生物检验的实验室应有符合无菌检查法和微生物限度检查法要求的、用于具有开展无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并为上述检验配备相应的细菌（真菌）等实验室、培养室、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和储藏区、标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。实验室应对进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规程，应按相关国家标准建立洁净室（区）和隔离系统的验证、使用和清洁维护标准操作规程，对可能影响检测结果的工作（如洁净度验证及监测、消毒、清洁维护等）能够有效地控制、监测并记录。4第四页，共五十五页，编辑于2023年，星期二洁净度的要求

应在环境洁净度10000级局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。5第五页，共五十五页，编辑于2023年，星期二5个基本概念⑴抑菌：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。⑵防腐：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。使用同一种化学药品在低浓度时为防腐剂，在高浓度时为消毒剂。⑶消毒：杀灭物体上病原微生物的方法。并不一定杀死含芽孢的细菌或非病原微生物。用来消毒的药品叫消毒剂。一般消毒剂在常用浓度下只对细菌的繁殖体有效，对其芽孢则需提高消毒剂的浓度和延长作用时间。⑷无菌：不存在活菌。⑸灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。比消毒要求高，它杀灭了包括细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。6第六页，共五十五页，编辑于2023年，星期二灭菌和消毒的比较：共性：杀灭微生物以控制其污染和防止传染。区别：1、杀灭微生物完全性的差异。灭菌要求完全杀灭微生物，灭菌后的药品不应含有活的微生物。而消毒不完全杀灭微生物，只能杀灭一部分微生物即病原微生物。这是相对的。因为强效消毒剂在适宜条件下可能达到灭菌效果；不适宜条件下灭菌，有不完全杀灭微生物的可能。2、方法上的差异：灭菌方法具有多样性，消毒常借化学物质。3、效果检查的差异：灭菌效果用无菌检查法检测，而消毒效果以消毒剂的效价评定。7第七页，共五十五页，编辑于2023年，星期二常用的消毒剂洁净室（区）常用的消毒剂甲醛薰蒸（作用机制：阻抑菌细胞核蛋白质合成。甲醛是一种常用的杀细菌和杀真菌剂。市售的福尔马林溶液就是37—40%的甲醛水溶液。常用于保存动物标本，也可以作气体熏蒸和液体消毒。甲醛有挥发性，对眼睛、皮肤有刺激性，引起皮肤硬化或皱褶，不宜做皮肤消毒用。）0.1%新洁尔灭溶液(作用机制：使蛋白质变性，破坏细胞膜。)75%酒精溶液（常用于皮肤消毒。能迅速杀死细菌繁殖体，对一般病毒有一定的消毒作用。）5%来苏水(甲酚皂)溶液（作用机制：损伤细胞膜）8第八页，共五十五页，编辑于2023年，星期二灭菌的方法1、热力灭菌：主要是利用高温的致死作用，使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，而导致细胞死亡。分为干热灭菌与湿热灭菌(1)干热灭菌：灼烧与火焰灭菌、干烤灭菌

灼烧主要用于接种工具灭菌，如接种针、接种环、刀、剪等在火焰上烧灼即可达到彻底灭菌。

火焰灭菌是在无菌操作中，将试管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等反复通过火焰数次，利用火焰对管口等进行灭菌，防止管口污染，作为无菌操作过程中的辅助灭菌手段。

干烤灭菌是利用热辐射及干热空气进行灭菌。9第九页，共五十五页，编辑于2023年，星期二2)湿热灭菌法：通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法。包括：煮沸灭菌、流通蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌煮沸灭菌：加热使水至沸而杀灭细菌的方法。凡不适于高压蒸汽灭菌的物品可常压下在水中煮沸一段时间达到灭菌目的。流通蒸汽灭菌：常压下，用蒸笼、蒸锅等在100℃灭菌。仅可杀死细菌繁殖体，不能完全杀灭芽孢。高压蒸汽灭菌：通过加压提高蒸汽温度，用高压蒸汽灭菌，穿透力强、温度高、灭菌效果最好。是最可靠最适用最广泛的灭菌方法，凡耐高温和潮湿的物品可应用本法灭菌。注意事项：完全排出高压灭菌器内的冷空气。（冷空气存在时，同一表压下所达到的温度值偏低，不符合规定的要求，灭菌就不彻底。)10第十页，共五十五页，编辑于2023年，星期二2、气体灭菌：利用化学消毒剂形成的气体来杀灭微生物。臭氧杀菌消毒广泛存在于自然界中，雷雨过后的空气有一种清新的感觉，是因为空中放电产生臭氧，消灭了空气中的微生物，净化了空气。臭氧具有强烈的杀菌消毒作用。其杀菌消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧和单个氧分子，后者具有很强的活性，对细菌具有很强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内氧化葡萄糖所必需的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧分子，不存在任何有毒残留物，故称为无污染消毒剂。不但对各种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，且对杀死霉菌也很有效。

11第十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期二3、辐射灭菌（1）电离辐射:用引起电离的X射线、γ射线灭菌。电离辐射对微生物的致死作用，主要是细胞内生物化学的变化所致。辐射的药品、食品的安全问题：辐射灭菌用于药品或食品都应经过安全试验，完全有必要进行科学全面的评价，高剂量的辐射更应慎重。Co60辐射灭菌后，被辐射物质的温度升高很少，一般仅约5℃，故Co60辐射灭菌又称“冷灭菌”。（2）电磁波辐射（包括紫外线[波长190～350nm]、红外线[波长0.77～1000μm]、微波[波长1～1000mm]）。12第十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期二紫外线灭菌1、紫外线辐射的穿透力很弱，因此主要用于无菌室、某些工作区的空气灭菌、物体表面灭菌。2、实践工作中在无菌室无菌柜净化工作台工作室及车间安装紫外灯，一般仅起杀死空气中部分微生物的作用，而不能起到完全灭菌的作用。3、紫外线消毒方法验证中紫外灯需确认的参数主要有紫外线的波长、紫外线强度、灯管的寿命。（254nm；90uw/㎡;1000小时）4、紫外灯消毒的效果与紫外线强度、照射时间、温度与湿度等因素有关，还需通过验证来确定。5、注意事项：紫外线直射对眼、皮肤有损害。紫外线照射过程中产生臭氧，臭氧过多对眼及鼻腔有刺激，产生头晕、胸闷、血压降低，所以无菌室及净化工作台紫外线照射停止后，请稍等片刻，让臭氧消散，方可进行实验操作。13第十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期二4、过滤灭菌：以物理的方法除去介质中的微生物。常将空气或液体中的微生物及杂质用不同材料制成的薄膜滤器过滤得到无菌、无杂质的空气或液体。滤过病毒的滤膜孔径为25～100nm；滤过细菌的滤膜孔径为0.22～0.45μm。14第十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期二实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用，使用要有记录。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并保存相关记录。微生物实验室所用的仪器应根据日常使用的情况进行定期的校准，并记录。校准的周期和校验的内容将根据仪器的类型和设备在实验室产生的数据的重要性的不同而不同。重要的仪器设备，如培养箱、冰箱等，应由专人负责，保证其运行状态正常和受控，同时应有相应的备用设备以保证试验菌株和微生物培养的连续性；对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数（如温度、压力）进行连续观测和记录，有条件的情况下尽量使用自动记录装置。如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。对于一些容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期进行清洁和消毒。对试验需用的无菌器具应实施正确的清洗、灭菌措施，并形成相应的标准操作规程，无菌器具应有明确标识并与非无菌器具加以区别。15第十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌种保存、复壮及管理

保存原则

保存方法复壮管理16第十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌种的保存原则挑选特征典型的纯菌菌落确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存选择最适宜的保存方法进行保存定期对保存的菌种进行检查17第十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌种保存的常用方法琼脂斜面低温保存法甘油冷冻管保藏法半固体琼脂斜面低温保存法液体石蜡保存法超低温保存法（菌种）砂土18第十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期二1.琼脂斜面低温保存法（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2-3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年至一年。有的甚至更长时间。（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏（3）特点：优点是——简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。缺点是——保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。19第十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期二4）注意事项：保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。20第二十页，共五十五页，编辑于2023年，星期二2、液体石蜡保存法：

本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。

（1）方法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.3-0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。（3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。21第二十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期二（4）注意事项：①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥,需重新移种。③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1㎝为宜。

⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。22第二十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期二3、半固体琼脂培养基（0.5%）4、40%甘油保存法：

23第二十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌种的复壮分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的分离通过宿主复壮淘汰退化理化因素诱变24第二十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期二

沙门菌——SS琼脂平板大肠埃希菌——EMB琼脂平板25第二十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期二铜绿假单胞菌——

溴化十六烷三甲铵琼脂培养基金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基26第二十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌种的管理专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等。定期有专人按操作规程进行传代接种。并做纯度、特性等实验室所需关键诊断指标的确认，并记录；每支菌种都应适当标注，注明其名称、标准号、接种日期、所传代数；菌种生长的培养基和培养条件。菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研究处理。实验菌种不得任意带出。使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处理。27第二十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]大肠埃希菌(Escherichiacoli))[CMCC(B)44102]枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC(B)50094]28第二十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌液的制备（1）接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中，30～35℃培养18-24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5

～10-7，使细菌数约为10～100cfu/ml。29第二十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌液的制备（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养18-24小时，取此培养物1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5-10-7，使细菌数约为50-100cfu/ml。30第三十页，共五十五页，编辑于2023年，星期二菌液的制备（3）

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加3-5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4-10-6，使细菌数约为50～100cfu/ml。

31第三十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期二药品微生物限度检查方法微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查均以本标准为依据。检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。32第三十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期二实验中的注意事项培养基配制的注意事项：采用干燥培养基，按说明配制，灭菌后对培养基pH值进行校验。配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。培养基的分装量一般不超过容器的1/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。培养基配制后在2h内灭菌，避免细菌繁殖，影响灭菌效果。灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，一般不超过1个月，倒好的碟子不过3～5天，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，不能反复使用。不用电炉直接熔化，以免局部过热营养成份被破坏。应用水浴或微波炉加热。33第三十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期二操作技术中的注意事项将物品一次准备完全，避免来回出入操作台、无菌室，全过程必须符合无菌技术要求。不溶于水的样品，必须加乳化剂、助溶剂等溶解后操作。勿在乙醇灯焰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭。加完稀释剂后，试管塞就立即塞上。快速吸管、吹打，不能用嘴吹吸，吸管内放棉花管尖不许接触可能污染的任何容器或用具稀释时每一级换管（原吸管不要吹洗），上一级吸管不能接触下一级稀释液34第三十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期二取均匀供试液稀释、注平皿（特别注意研细）上清液和沉淀物影响测定结果注平皿时，要求管内不残留溶液3.3制最准确，即3级稀释，3个平皿，但厂方也可根据自己品种选择培养基严格控制在45±1℃，水浴。培养基摇合快速、均匀，不要溅到皿边和皿盖上。从稀释到倾注培养基全部操作在1小时内全部完成。35第三十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期二结果判断的注意事项不要漏计细小的（可适当延长培养时间）、琼脂内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌、酵母菌及霉菌的区别，以及菌落与药渣、培养基沉淀、药物结晶的区别。平均菌落在15个以下时，二个平皿的菌落数不在0－4，1－7，2－9，3－10，4－12，5－14，6－15范围内；平均菌落在15个以上时，二个平皿菌落数超过1倍；三级菌落数不能显示差别。不能计数需重新实验。36第三十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期二异常情况处理菌落蔓延1.加TTC（1000ml营养琼脂加1％的TTC1ml）2.开盖干燥（倒置斜放1～2h）3.换陶瓦盖（干热灭菌的）异常菌落数报告法

细菌平皿上长霉菌、霉菌平皿上长细菌，哪个多，以哪个计数，不能相加计数。37第三十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期二药品微生物检查法的验证

38第三十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期二

●无菌产品无菌检查方法的验证●控制菌检查方法的验证●细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证39第三十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期二●验证的目的:确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查或微生物限度检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。

●验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。40第四十页，共五十五页，编辑于2023年，星期二药品无菌检查方法的验证（1）验证用菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。菌株选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:＜100cfu。41第四十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期二药品无菌检查方法的验证（2）验证方法：直接接种法、薄膜过滤法。结果判断：如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，供试品照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查法检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和剂或灭活剂；更换滤膜品种等方法，并重新进行方法验证。42第四十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期二微生物限度检查的验证内容细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证--准确性(回收率)控制菌检查法的验证--专属性43第四十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期二细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证⑴验证用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。44第四十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期二计数方法的验证-验证方法⑵验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。45第四十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期二计数方法的验证-验证方法⑶试验组菌液组稀释剂对照组供试品对照组46第四十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期二试验组平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。47第四十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期二

稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。菌液组：测定所加的试验菌数。供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。48第四十八页，共五十五页，编辑于