高性能富硒产朊假丝酵母的制备

高性能富硒产朊假丝酵母的制备王大慧;葛晓光;卫功元;刘志奎【摘要】TheeffectsofNa2SeO3additiontimeandL-methioneonthebiomass,glutathionebiosynthesis,intracellularglutathionecontentandseleniumorganictransformationrateduringselenium-enrichedCandidautilispreparationina5Lstirredfermentorwereinvestigated.AneffectiveculturestrategywhichinvolvedL-methioneadditionatthebeginningofcultivation（0h）andNa2SeO3additionafterglucoseconsumption（15h）wasobtainedwiththeaimofhighorganicseleniumcontentandhighintracellularglutathionecontentwithintheselenium-enrichedC.utilis.Usingthisstrategy,theseleniumorganicbiotransformationratecanreach87.5%.%在5L发酵罐上，分别考察了亚硒酸钠添加时间和L-蛋氨酸对富硒产朊假丝酵母制备过程中的细胞量、谷胱甘肽合成、胞内谷胱甘肽含量以及硒有机转化率的影响。以高性能（高有机硒含量、高GSH含量）富硒酵母的制备为目标，得到一种比较有效的发酵培养策略，即发酵初期（0h）添加L-蛋氨酸以及葡萄糖耗尽时（15h）添加亚硒酸钠，最终硒有机转化率达到87.5%。【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷)，期】2011(037)006【总页数】4页(P106-109)【关键词】富硒酵母;产朊假丝酵母;谷胱甘肽;制备;L-蛋氨酸【作者】王大慧;葛晓光;卫功元;刘志奎【作者单位】苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123;苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123【正文语种】中文【中图分类】TS213.21硒和谷胱甘肽(GSH)对生物体有诸多益处。硒是人体必需的微量元素之一，具有抗癌、解毒、提高免疫力、延缓衰老等多种生理功能［1］，是生物体内谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的重要组成部分［2］,GPx可以分解生物体内的有害过氧化物，清除自由基，防止细胞膜氧化受损和体内重金属的积累［3］。食品及饲料添加剂中的硒对于提高人们健康水平、防止缺硒弓I起的各种疾病具有特殊意义［4］。硒的补充可以通过摄入无机硒或有机硒而得以实现。无机硒的毒性较高，因而限制了它的广泛使用;有机硒的安全性能和利用率虽然远远优于无机硒，但纯的硒代蛋氨酸价格昂贵，因此必须寻找一种有机硒的廉价生产方法。利用微生物如酵母将无机硒生物转化为有机硒被认为是一条安全高效的途径［5］。GSH在抗辐射、癌症、氧中毒、衰老和协调内分泌的治疗中效果明显且无副作用，可以广泛应用于医药、保健品、化妆品以及食品和饲料添加剂等诸多领域［6］。GSH在增强食品营养价值和强化食品风味的同时对人体又有保健作用，是食品抗氧化剂发展的必然趋势［7］。酵母菌如产朊假丝酵母是GSH生物合成的最具有潜力的微生物［8］。在富硒产朊假丝酵母的制备过程中，酵母细胞在将亚硒酸钠进行有机转化的同时，提高了谷胱甘肽过氧化物酶的活性，增加了胞内GSH的氧化;另外，亚硒酸钠也会导致GSH向胞外泄漏［9］。因此，非常有必要采取相关措施在制备富硒酵母的同时提高胞内GSH含量。添加L-蛋氨酸在增强产朊假丝酵母富硒能力的同时还可以提高胞内GSH含量[10],本文在此基础上，考察L-蛋氨酸在高性能富硒产朊假丝酵母制备过程中的作用，为工业化生产胞内积累GSH的富硒产朊假丝酵母奠定基础。1材料与方法1.1菌种产朊假丝酵母(Candidautilis)SZU07-01,微生物工程实验室保存。1.2培养基斜面及种子培养基(g/L):葡萄糖20.0，蛋白腺10.0，酵母膏10.0,pH6.0。发酵培养基(g/L):葡萄糖30.0,(NH4)2SO48.0,KH2PO43.0,MgSO40.25,pH6.0。1.3培养方法种子培养:斜面菌种活化4h后，接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养20h，培养温度30°C,摇床转速200r/min。发酵罐培养:全自动5L搅拌式发酵罐(BIOTECH-5BGZ，上海保兴生物设备工程有限公司)中装发酵培养基3L,接种量10%(v/v)，搅拌转速350r/min，温度27C,通气量3.0L/min，培养时间30h。pH采用梅特勒电极在位检测，通过自动流加3mol/LH2SO4或3mol/LNaOH溶液进行调节以维持pH值变化在6.0±0.02以内。Na2SeO3添加浓度为10mg/L,添加时间根据实验要求确定;L-蛋氨酸添加浓度为10mmol/L，在发酵培养基中添加，即0h时添加。1.4酵母生物量的测定以细胞干重(DCW)表示酵母生物量。取25mL发酵液，3500r/min离心10min,蒸馏水离心洗涤3次，收集菌体，70C烘干至恒重。1.5分析方法葡萄糖、谷胱甘肽的测定方法见文献［10］。细胞内总硒、无机硒的测定及硒的有机转化率的计算见文献［8］。1.6胞内GSH含量的计算胞内GSH含量(IGC)定义为单位质量细胞在胞内合成GSH的总量，即2结果C.utilisSZU07-01的生长曲线在5L发酵罐上考察了C.utilisSZU07-01细胞的生长代谢情况(图1对照)，发现在酵母细胞培养15h时，葡萄糖消耗完毕;细胞干重在24h达到最大值13.15g/L,胞内GSH含量在30h达到1.56%。在这些时间点的基础上，考察不同时间添加Na2SeO3对富硒产朊假丝酵母性能的影响。图1不同时间下Na2SeO3的添加对富硒产朊假丝酵母发酵生产的影响(注:对照表示不添加Na2SeO3的产朊假丝酵母发酵过程;0hSe表示在发酵培养的开始添加Na2SeO3;15hSe表示在15h时添加Na2SeO3)Na2SeO3添加时间对富硒酵母制备的影响分别在发酵开始(0h)和糖耗结束(15h)时向发酵液中一次性添加Na2SeO3至终浓度10mg/L(图1),考察富硒酵母的生长和代谢变化情况。结果发现，当0h添加Na2SeO3时，酵母细胞生长受到抑制，迟滞期明显延长。葡萄糖的消耗速率降低，至30h时葡萄糖才利用完毕，与此相对的是，当在15h添加Na2SeO3时，酵母细胞的生长及代谢基本不受影响，但硒的有机转化率却提高了5.3%。2.3添加L-蛋氨酸对富硒产朊假丝酵母性能的影响前期研究发现，在摇瓶中添加适量浓度L-蛋氨酸可以促进富硒产朊假丝酵母的生长，同时也可以提高胞内GSH含量和硒的有机转化率［10］。因此，选择L-蛋氨酸作为提高富硒酵母性能的合适氨基酸并在发酵培养基中添加(图2)。结果显示，酵母细胞生长、代谢特性均出现了积极的变化，硒有机转化率也超过了87%。2.4不同培养方式下富硒产朊假丝酵母的参数比较针对富硒酵母在生产实际中的应用范围，在富硒产朊假丝酵母的制备过程中，高性能(高有机硒含量、高GSH含量)是研究者追求的目标之一。为此，在常规制备方法的基础上(图1)，需要采取一定的培养策略以提高这些指标，增强富硒酵母的应用价值。表1比较了不同培养方式下，富硒产朊假丝酵母制备过程中一些关键的过程参数。通过比较，发现在酵母培养的0h向发酵培养基中提供10mmol/L的L-蛋氨酸、在葡萄糖消耗结束的15h添加10mg/L的Na2SeO3，可以获得高性能的富硒产朊假丝酵母。图2L-蛋氨酸和Na2SeO3的混合添加对富硒产朊假丝酵母发酵生产的影响(注:图2中所有发酵过程均在培养开始即加入L-蛋氨酸(10mmol/L)。对照表示不添加Na2SeO3的产朊假丝酵母发酵过程;0hSe表示在发酵培养的开始添加Na2SeO3;15hSe表示在15h时添加Na2SeO3。)表1不同培养方式下制备富硒产朊假丝酵母的发酵过程参数比较？3讨论3.1Na2SeO3添加时间对C.utilisSZU07-01生理特性的影响在C.utilisSZU07-01发酵初期加入Na2SeO3会使细胞消耗葡萄糖的时间延长1倍，最终细胞干重降低30%。这说明在发酵初期进行富硒，富硒过程与酵母细胞生长同步进行，细胞的生长会受到一定程度的抑制。同时，发酵起始富硒也导致C.utilisSZU07-01的GSH合成和胞内GSH含量分别降低45%左右。这是因为:(1)Se作为生物体内GPx活性位点的重要组成部分，无机Se的生物转化会提高GPx的活性而增加GSH的氧化[11];(2)Na2SeO3也会导致GSH向细胞外的泄漏[9],而GSH在胞外则很容易被氧化;(3)还原型GSH能将细胞内甲基硒酸或硒氨基酸、L-硒蛋氨酸或L-硒甲基硒半胱氨酸等还原为低氧化态形式，低氧化态硒在被O2、H2O2或其他过氧化物氧化成高氧化态形式的同时可产生活性氧自由基，高氧化状态硒又不断被还原为低氧化态硒，如此往复循环。细胞中硒浓度越高，GSH越少，产生的活性氧自由基越多。与此同时，当在葡萄糖消耗殆尽的时候添加Na2SeO3进行富硒培养，由于酵母菌已经基本完成了细胞生长过程，因此，C.utilisSZU07-01的细胞量、GSH产量和胞内GSH含量在富硒的同时能基本保持在原有水平。且Se有机转化率能保持在80%左右。因此，根据以上结果可以看出，选择在葡萄糖耗尽时进行富硒可以在保证较高的Se有机转化率的同时，也有利于富硒C.utilisSZU07-01细胞生长、GSH合成和胞内积累。L-蛋氨酸的添加策略L-蛋氨酸是常见氨基酸之一，在酵母细胞内可以和ATP结合形成S-腺苷蛋氨酸(SAM),而SAM又可以通过一定的代谢途径转化为L-半胱氨酸，进而进入GSH的合成代谢途径［12］。L-蛋氨酸在缓解发酵起始阶段Na2SeO3对酵母细胞生长抑制方面作用明显，使C.utilisSZU07-01尽快进入对数生长期，最终的细胞量也有了大幅度的提高。另外，L-蛋氨酸对于GSH合成和胞内GSH含量的提高也非常有帮助，使富硒酵母细胞的各项指标甚至达到了C.utilisSZU07-01原有的水平。在葡萄糖耗尽时添加Na2SeO3进行富硒时，在发酵初期添加L-蛋氨酸可以使各项发酵指标均已超过了C.utilisSZU07-01的原有水平。通过在发酵起始时添加L-蛋氨酸以及葡萄糖消耗结束时富硒的培养策略，可以极大地促进富硒产朊假丝酵母的细胞量、GSH合成能力以及胞内GSH含量，最终Se的有机转化率达到87.5%。4结论实验在5L发酵罐上考察了Na2SeO3的添加时间以及L-蛋氨酸对于提高富硒产朊假丝酵母细胞量、GSH合成、胞内GSH积累以及Se有机转化率的作用，获得了一种有效的富硒产朊假丝酵母制备策略，即发酵初期(0h)向发酵培养基中加入L-蛋氨酸以及在葡萄糖耗尽时(15h)添加Na2SeO3。应用该策略制备得到的高Se有机转化率、高胞内GSH含量的富硒产朊假丝酵母，在补充硒的同时又提高了机体的免疫力，在医药、保健品、化妆品及食品和饲料添加剂等多种领域势必将具有更为广阔的应用和市场前景。参考文献[1]孙长峰，郭娜.微量元素硒的生理功能[J].微量元素与健康研究，2007,24(6):67-68.[2]RotruckJT,PopeAI,GantherHE,etal.Selenium:biochemicalroleasacomponentofglutathioneperoxidase[J].Science,1973,179(4073):588-590.[3]MarlnhoSH,AntunesF,PintoRE.Roleofglutathioneperoxid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