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文档简介
实验一分光光度技术及蛋白含量测定第一页,共二十八页,编辑于2023年,星期二理论
掌握分光光度技术的基本原理了解分光光度计的基本构造实验
利用分光光度计进行蛋白质定量测定
1.双缩脲法测定蛋白质含量
2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量
3.紫外分光光度法测定蛋白质含量
本次实验内容第二页,共二十八页,编辑于2023年,星期二分光光度技术(Spectrophotography)第三页,共二十八页,编辑于2023年,星期二
一、基本定义
利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。
应用:定性、定量
优点:灵敏度高精确度高操作简便、快速
第四页,共二十八页,编辑于2023年,星期二二、工作原理
1.物质对光线有选择性吸收作用。
2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。
3.在一定条件下,物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。
分光光度法所使用的光谱范围:200nm--10μm200-400nm400-760nm760-10000nm紫外光区可见光区红外光区第五页,共二十八页,编辑于2023年,星期二如何定性?
—
利用吸收光谱鉴定化合物利用分光光度计绘制吸收光谱曲线
用各种不同的单色光分别通过某一溶液,测定此溶液对每一种单色光的吸收度,以波长为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线,即吸收光谱曲线。每种物质有其特征性的吸收光谱第六页,共二十八页,编辑于2023年,星期二
1.朗伯(Lambert)定律
一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。
I/I0=e-K1lI0:入射光强度;I
:透射光强度;l:介质厚度
如何定量?
—
Lambert-Beer定律第七页,共二十八页,编辑于2023年,星期二2.比尔(Beer)定律一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。
I/I0=e-K2CI0:入射光强度;I
:透射光强度;C:介质浓度
第八页,共二十八页,编辑于2023年,星期二3.Lambert-beer’slaw的合并一束单色光通过某溶液时,光波被溶液吸收一部分,吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。
I/I0=e-εclA=-lgI/I0=εcl
A:吸光度;C:溶液浓度;L:液层厚度
ε:即摩尔消光系数,也叫摩尔吸光度,溶液浓度为mol/L,光程为1cm时的消光系数第九页,共二十八页,编辑于2023年,星期二4.计算(1)标准管法(标准比较法)
实际测定过程中,用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色,读出吸光度,再根据前式计算。A标准=ε标准C标准L标准
A样品=ε样品C样品L样品
A:吸光度;ε:摩尔吸光度;C:溶液浓度;L:液层厚度第十页,共二十八页,编辑于2023年,星期二因标准液和样品液中溶质为同一物质,
ε样品=ε标准因盛标准液和测定液的比色杯径长相同
L样品=L标准故上二式可写成:A标准/A样品=ε标准C标准/ε样品C样品
C样品=A样品/A标准×C标准第十一页,共二十八页,编辑于2023年,星期二(2)标准曲线法
配制一系列已知不同浓度的测定物溶液,按测定管同样方法处理显色,分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标,吸光度为纵座标,在方格座标纸上作图得标准曲线,根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。
第十二页,共二十八页,编辑于2023年,星期二标准曲线使用注意事项①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。②吸光度在0.05-1.0范围内。③所作标准曲线仅供短期使用。④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行,避免误差产生。第十三页,共二十八页,编辑于2023年,星期二5.应用中注意的问题①Lambert-beer’slaw的偏离:该定律只适应于一定浓度范围,稀溶液能很好的服从该定律,A宜在0.05~1.0之间,超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符②选择波长:最大吸收波长,因为a.灵敏;b.避免杂质干扰③参比溶液(空白管):消除背景效应,应包含除待测溶质以外所有的成分。第十四页,共二十八页,编辑于2023年,星期二
空白管:
测量过程中,因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收,故设置一个空白管,即其中除了待测溶质以外,其它的成分完全相同。测量时,首先以空白管对准光路对仪器调零,既消除比色皿本身对光的吸收,又消除了非待测物对光的吸收,所测值即为待测物造成的光吸收。第十五页,共二十八页,编辑于2023年,星期二分光光度计第十六页,共二十八页,编辑于2023年,星期二一.基本部件
1.光源分光光度计上常用的光源有两种,即钨灯和氢灯
(或氘灯)。在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨灯;在紫外光区,多使用氢灯。
2.单色器棱镜或光栅,把混合光分解为单一波长的光。
3.吸收池(比色皿、比色池)选用合适的比色皿(可见光—玻璃;紫外光–
石英;规格、新旧程度一致)
4.检测器
5.测量装置
第十七页,共二十八页,编辑于2023年,星期二二.分光光度计使用步骤(示教)三.使用时注意事项
1.波长选择。
2.机器预热。
3.不测量时,应使样品室盖处于开启状态,否则会使光电管疲劳。
4.不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。
5.比色皿使用注意事项第十八页,共二十八页,编辑于2023年,星期二
1.由于紫外光不能透过玻璃比色皿,紫外光区测量时要用石英比色皿。
2.同组使用的比色皿必须配套(规格、新旧程度一致)。
3.比色皿2光面与2毛面,光学表面对准光路,不能有任何污损,否则会引起光吸收的增加。
4.比色皿中所盛溶液不能太少,也不能太多,一般所盛液体约占全部容积的2/3。
5.腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。
6.每次使用后,应立即倒空或以吸液泵吸干,然后用水冲洗比色皿3~4次。本次试验,考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色,酒精浸泡后清洗。第十九页,共二十八页,编辑于2023年,星期二蛋白质定量分析实验实验一双缩脲法测定蛋白质含量
实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量
实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量
第二十页,共二十八页,编辑于2023年,星期二实验一双缩脲法测定蛋白质含量【基本原理】
蛋白质分子中含有许多肽键,与双缩脲结构类似,在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物(称双缩脲反应)。在一定浓度范围,颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应,故氨基酸无此反应。双缩脲法的灵敏度为1-20mg。第二十一页,共二十八页,编辑于2023年,星期二试剂(ml)
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5
6标准蛋白质溶液0.10.30.50.70.9—生理盐水0.90.70.50.30.11.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0【操作步骤】(一)标准曲线的绘制1.取小试管6支,编号按下表操作
2.混合后,于37℃水浴中放置15分钟,在520nm波长下比色,以
第6管调零,测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵座标,蛋白质浓度的克数为横座标,绘成曲线。第二十二页,共二十八页,编辑于2023年,星期二(二)样品测定:
取血清样品0.1ml,加生理盐水0.9m1,再加双缩脲试剂4m1,于37℃水浴中放置15分钟,测其吸光度,根据吸光度值查标准曲线并计算得出每l00ml血清(样品)中蛋白质的克数。
注意:双缩脲法的灵敏度为1-20mg,取蛋白标准液时注意浓度实验时,样品管可与标准管同时处理第二十三页,共二十八页,编辑于2023年,星期二【基本原理】
考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质可通过范德华力结合,与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色,最大吸收峰从465nm变成595nm,能过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
优点:灵敏度高,1-5μg;测定速度快;干扰物质少。现已被广泛使用。实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量第二十四页,共二十八页,编辑于2023年,星期二1.取试管3支,编号按下表操作
试剂(ml)空白标准标本生理盐水0.1
蛋白标准液(50ug/ml)0.1
样品0.1
考马斯亮蓝试剂5.05.05.02.混匀,放置5分钟,在波长595nm处,以空白管调“0”,测定各管的吸光度。【操作步骤】第二十五页,共二十八页,编辑于2023年,星期二3.计算
A标本/A标准
×50(µg/ml)
=样品中蛋白质的含量(µg/ml)
注意:蛋白标准液浓度50µg/ml第二十六页,共二十八页,编辑于2023年,星期二实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量【基本原理】
由于蛋白质分子中含有酪氨酸,色氨酸等芳香族氨基酸,因而蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少,因此在此波长范围内,吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系,可作定量测定。灵敏度:50-100μg第二十七页,共二十八页,编辑于2023年,星期二【操作步骤】(一)制作标准曲线
1.取试管6支,编号,按下表操作。试剂(ml)12345
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