干细胞培养技术(合集7篇)

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时间：2023-06-0615:45:29

干细胞培养技术第7篇

1998年11月，米国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（EScells）和胚胎生殖细胞系（EGcells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。

ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。

1胚胎干细胞的一般定义特征

考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。

2胚胎干细胞的最新研究

JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层，在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。

Shamblott和同事［2］在《米国科学院论文集》上，报道从受精5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和forskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久，但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管）。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是确实观察到了在胚状体（embryoidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。

人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的ES细胞却没有这种作用［1，2］。

在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

3胚胎干细胞应用前景探讨

人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。

人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。

另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法，即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”，并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。

利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不会形成杂种细胞。

4面对的挑战

要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。

5其他替代胚胎干细胞应用的技术

由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们

正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以

认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限

分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些

早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内

皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细

胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更

新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult

stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出

来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细

胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较

慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干

细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提

供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte

grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］

。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干

细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一

系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的

细胞，表现出一定的多能性［17～20］。

Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后

的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，

这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret

A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有

种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续

还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血

液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨

骼肌细胞［2