第十七章高效液相色谱分析课件

第十七章高效液相色谱分析17.1概述17.2HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;辅助系统17.3流动相和固定相简介17.4高效液相色谱方法各论分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱17.1概述高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10m

）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途！3.应用

由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象极性增加不溶于水溶于水非极性离子非极性离子吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量17.2HPLC仪器

HPLC仪器包括：高压输液装置;

进样系统;

分离系统;

检测系统;

此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。He储液瓶分布器过滤2m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器HPLC仪器详解1.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很小，约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。

恒压泵:(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。

恒流型:溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。2.进样系统

与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱3.色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。4.检测器

液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。

HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。

在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液波长可的松氟美松皮质酮快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图2）荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。3）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板4）安培检测器

由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5L）组成。如图。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)5）电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。其它检测器还包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、极谱等。17.3HPLC流动相和固定相简介一、固定相载体由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。1.按承受压力分刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108~1.0×109Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱；硬胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5×108Pa,主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。2.按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混合物的分离。二、流动相与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参与对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2溶剂的特性参数主要包括溶剂强度参数、溶解度参数和极性参数等，具体见P357表17.21对流动相的要求1）对待测物具一定极性和选择性；2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什么？)；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。1）、溶剂强度在吸附色谱中，通常固定相是极性的硅胶或氧化铝，而溶剂是非极性的，或含有极性溶剂的混合溶剂。采用溶剂强度ε0将溶剂排队，一般定义正戊烷的ε0为零，其它的见表。ε0越大-----溶剂极性越大------k’越小。2）、溶解度参数在分配色谱中（例如为反相色谱），固定相是非极性的，溶剂是极性的，溶剂的作用更大，溶剂强度与溶剂的极性成反比。溶解度参数更好地代表溶剂的极性。溶解度参数由四个部分组成=d+0+a+h其中：d

----色散力o------偶极矩

a,h

---质子给予、接受的一种量度3)、选择性参数

P’=log(K’’g)e+log(K’’g)d+log(K’’g)nP’-----极性参数K’’g---与溶剂汽化自由能成比例的极性分布系数。它分别根据乙醇（e）二噁烷（d）和硝基甲烷（n）中的数据计算。选择性参数

xe=log(K’’g)e/P’xd=log(K’’g)d/P’xn=log(K’’g)n/P’

根据溶剂强度和极性参数分类、排队，只代表k’值，对于难分离物质对，要根据溶质与溶剂之间的特殊作用才能分离。每种溶剂可以得到xe、xd、和xn三个数据，根据数值在三角形平面坐标上找所在位置。位置不同分成八个区域，每个区域的溶剂有类似的性质。见P359图17.113、流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)17.4高效液相色谱方法各论

按分离原理可将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。一、分配色谱原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2.流动相:HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系3.固定相

原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。2）化学键合固定相

化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）。二、化学键合相色谱法（CBPC）采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。1．键合固定相类型用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐,作为阳离子交换基团的磺酸等。时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。2．键合固定相的制备（1）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的键合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：≡Si－OH＋ROH→≡Si－OR＋H20由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内。（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相，制备反应：（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相制备反应：这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，pH=2～8范围内正常工作，应用较广泛.3.正相和反相键合色谱法4.离子型键合相色谱法当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H一CH2NH2、－COOH、一CH2N(CH3)Cl等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。三、液一固吸附色谱法(LSAC)液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。1．分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS达平衡时,有其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。2．固定相吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。3、流动相一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0

）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。表17-4列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0值。在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。(四）离子交换色谱法（IEC）此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。1．离子交换原理

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：式中[A]r，[B]r

分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。

对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季胺型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2．固定相

作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分按离子交换剂类型分四种：

按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。1）多孔型：

聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m)多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆3.流动相

离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)

，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对—R+或—R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+XRM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。五、离子色谱法（IC）离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：R+－OH-＋H+Cl-→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl-→M+OH－＋R+－Cl-

由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2．6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。

该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。

在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。六、离子对色谱法（IPC）离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。1.原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相（常为有机相）中，使待测离子A与对离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+：由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3……..因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。2．键合相反相离子对色谱法

离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性可分为反相离子对和正相离于对色谱法。其中以键合反相离子对色谱法最重要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水键合相［如十八烷基键合相（ODS）等］，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。根据离子对生成反应式，平衡常数KAB可表示为

根据