适宜技术应对结核感染

1.结核病背景资料2.

结核病病原学实验室诊断3.体外r-干扰素释放试验4.小结当前第1页\共有52页\编于星期四\23点背景—结核病流行现状全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆菌我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4当前第2页\共有52页\编于星期四\23点背景—结核病感染、传播、发病过程潜伏感染

染肺病或其他疾病潜伏感染复发

细菌在人体复制播散

Disseminates发作

Onset康复

Recovery时间表Time诊断

Diagnosis治疗

Treatment痊愈≥2个月（months）当前第3页\共有52页\编于星期四\23点背景—当前结核病的研究新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%)JID2012:205(Suppl2),S147.当前第4页\共有52页\编于星期四\23点背景—结核分枝杆菌基础结核分枝杆菌（M.tuberculosis）简称为结核杆菌（tuberclebacilli）。早在1882年，德国细菌学家柯赫（RobertKoch）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。在微生物分类中，结核分枝杆菌属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌当前第5页\共有52页\编于星期四\23点背景—结核分枝杆菌基础（1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。（2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括：①磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关②分枝菌酸：与抗酸染色性有关③索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关④硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用⑤蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应。（3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫当前第6页\共有52页\编于星期四\23点背景--结核病患者的发现症状：肺结核病可疑症状者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者,或有咯血症状者发现方式：因症求诊、转诊和因症推荐是发现肺结核病人的主要方式当前第7页\共有52页\编于星期四\23点背景--结核病患者的诊断肺结核诊断标准：按照新修订的肺结核诊断标准（WS288-2008），肺结核分确诊病例、临床诊断病例和疑似病例。当前第8页\共有52页\编于星期四\23点背景--结核病实验室的任务ProvideEarlyandAccurateDiagnosis提供早期精准诊断Initiationofrighttreatmentandinterventionearly制定正确治疗方案并早期干预Monitoringtherapyefficacyinapromptmanner迅速的监测疗效Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment在开发抗结核药物同时发展新的治疗及诊断手段当前第9页\共有52页\编于星期四\23点结核病实验室诊断技术简介1.结核抗体2.结核蛋白芯片3.体外r-干扰素试验4.结核杆菌分泌抗原1.涂片2.培养3.药敏4.菌型鉴定细菌学免疫学分子生物学其他1.HPLC2.质谱技术3.流式技术1.实时荧光定量PCR2.DNA3.RNA4.耐药基因突变5.菌型鉴定6.测序当前第10页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌形态学检测1.直接抹片法2.离心制片法1.抗酸染色2.荧光染色1.普通显微镜2.荧光显微镜3.自动阅片技术涂片染色镜检当前第11页\共有52页\编于星期四\23点结核杆菌形态学检测--离心制片技术直接涂片法离心制片法合计阳性阴性阳性41041(15.9%)阴性17199216(84.1%)合计58（22.6%）199(77.4%)2572015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。当前第12页\共有52页\编于星期四\23点结核杆菌形态学检测--自动阅片技术2016年2月至2016年3月，本院对308例涂片进行人工阅片和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为286例，总符合率为92.58%。当前第13页\共有52页\编于星期四\23点结核病诊断金标准—结核分枝杆菌培养分枝杆菌全自动连续检测系统-------BACTECMGIT960操作简单安全可靠性能优异高性能价格比M=MycobacteriumG=GrowthI=IndicatorT=Tube当前第14页\共有52页\编于星期四\23点结核病诊断金标准—结核分枝杆菌培养检测对象CO2O2检测手段颜色荧光发光元素培养基改良MiddleBrook7H9营养添加剂抑菌剂

灵敏，快速，安全阴性培养无荧光或弱荧光阳性培养FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器肉汤上部空间当前第15页\共有52页\编于星期四\23点结核病诊断金标准—结核分枝杆菌培养简单的工作流程当前第16页\共有52页\编于星期四\23点结核病诊断金标准—结核分枝杆菌培养BACTECMGIT960阳性结果判读1.抗酸染色2.普通培养—血平板3.MPB64抗原检测当前第17页\共有52页\编于星期四\23点结核病诊断金标准—结核分枝杆菌培养BACTEC9120只能做血培养？标本：血液、无菌体液我可以的！------普通细菌、真菌分枝杆菌当前第18页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验结核杆菌体外药敏试验MIC测定法固体培养法液体仪器法液体微量法当前第19页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验药敏系统采用NCCLs推荐的比例法(MOP)，判断的临界值为1%药敏试剂包括:SIREKit(Streptomycin,Isoniazid,RifampinandEthambutol)4-13天PZAKit4-21天SIRESusceptibilityoptions:另有单独包装的高浓度药物S，I，E(在低浓度耐药情况下，可用于高浓度实验)BACTECMGIT960药敏系统当前第20页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验MGITPlasticTubesBACTEC960SIREKITMyco/FLytic25packBACTEC960PZAKit960directLISBACTEC960forG&DManualMGITBACTEC460TBBACTEC9000MB2003BDisalwaystheLEADER结核分枝杆菌药敏试验的金标准----MGIT960EpiCenterforthe960当前第21页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验

DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3++++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible当前第22页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验1234

挑取菌落磨菌、稀释接种菌液孵育7-10天显色，读取结果结核分枝杆菌液体微量药敏当前第23页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验

收集我院2015年8月至11月的临床分离菌株511例，使用液体微量显色法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的体外药敏试验

。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。药物RFPINHSMEMBCPMOFXETHPASLVFMOFRFBAMIKANCLO耐药例数80146945850614149536260111387耐药率%15.728.618.411.49.811.98.09.610.42.517.0当前第24页\共有52页\编于星期四\23点结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验

收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117例，使用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、

利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。总符合率超过90%。当前第25页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术当前第26页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断结果判断当前第27页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断溶解曲线法比例法药敏敏感度特异度阳性预测值%阴性预测值%总符合率%敏感耐药%%INH敏感110490.598.295.596.696.1耐药238RFP敏感103295.897.2耐药346收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。并对耐药结果不相符的11株菌进行了基因测序分析，均证实有耐药基因突变。当前第28页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA)RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷贝数更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.较好的愈后指标当前第29页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断

统计今年我院住院患者179例，分析涂片、培养和TB-RNA检测报告，结果如下：患者类型例数TB-RNA阳性例数阳性率涂片阳性272385.2%涂片阴性1424128.9%培养阳性686291.1%培养阴性11121.8%我院涂片、培养阳性率分别为：15.1%和37.9%；TB-RNA的总阳性率为35.8%。当前第30页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断三、EasyNATTB-DNA检测（恒温扩增法）原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时一次性完成TBDNA的扩增及杂交过程，然后用一次性核酸检测装置进行定性诊断。检测目标片段:目标为结核分枝杆菌

特异性IS6110片段。当前第31页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断操作步骤当前第32页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断

2015年6月，我科参加CTCTC“EasyNAT®结核分枝杆菌核酸检测试剂盒现场应用评估”项目,结果如下：

患者类型例数EasyNATTB-DNA检测阳性率%阳性阴性涂片阳性770100.0涂片阴性432414.7培养阳性1091*90.0培养阴性400400.0注*：1例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌当前第33页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断四、Gen-XpertMTB/RIF进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理GeneXpert设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变容易使用，不需要进行分子生物学培训操作完全自动化，使用起来既容易又安全。当前第34页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与PCRTB-DNA检测的比较：阳性符合率＝99.03％，阴性符合率＝92.61％，总符合率＝95.31％Gen-XpertPCRTB-DNA合计阳性阴性阳性20421225阴性2263265合计206284490当前第35页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断涂片阳性肺结核:Xpert检出率=99.35％涂片阴性肺结核:Xpert检出率=35.32％Gen-Xpert涂片结果合计阳性阴性阳性15271223阴性1130131合计153201354当前第36页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与BD960液体培养比较实验：阳性符合率＝95.52％，阴性符合率＝95.51％，总符合率=95.51％Gen-Xpert培养+鉴定结果合计阳性阴性阳性21312225阴性10255265合计223267490当前第37页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与比例法药敏比较实验：阳性符合率

＝96.88％，阴性符合率

＝95.53％，总符合率

＝95.73％，Gen-Xpert利福平药敏试验合计耐药（阳性）敏感（阴性）耐药（阳性）31839不确定022敏感（阴性）1171172合计32179211当前第38页\共有52页\编于星期四\23点结核病分子生物学诊断WHO关于XpertMTB/RIF的建议XpertMTB/RIF应该用于MDR-TB的高危人群、以便尽早发现MDR-TB患者，有效控制疫情。XpertMTB/RIF在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测。当前第39页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验蛋白质水平结核菌素试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)当前第40页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验γ

干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素当前第41页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验

特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)

灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)当前第42页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）实验效果图当前第43页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散快速48小时出结果当前第44页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验

阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正常操作。

阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）当前第45页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验WHO2014《潜伏结核感染管理指南》建议：1、在HIV感染人群、与肺结核患者密切接触的成人和儿童、开始接受抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的患者、接受透析治疗的患者、准备接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中开展LTBI系统检测和治疗。检测LTBI建议使用γ-干扰素释放试验（IGRA）或结核菌素皮试（TST）。2、对于羁押人员、医务人员、来自结核病高负担国家的移民、无家可归者、以及吸毒人员，可以有条件地开展LTBI系统检测和治疗。3、对于糖尿病人、酒精依赖者、吸烟成瘾者、低体重者，如果他们不属于以上1和2的情况，并不建议常规开展LTBI的系统检测。当前第46页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验LTBI筛查和诊断的建议流程

当前第47页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验Menzies等在2007年发表的一篇纳入8项研究的meta分析论文中指出，IGRA对于普通人群，尤其是曾经接种过卡介苗的人群诊断LTBI具有较高的特异度；但和TST一样，IGRA的敏感度差强人意，两者均不能区别LTBI和活动性结核病

----MenziesD,PaiM,ComstockG.Meta-analysis:newtestsforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection:areasofuncertaintyandrecommendationsforresearch.AnnInternMed,2007,146:340-354.

IGRA诊断LTBI的价值当前第48页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验IGRA诊断活动性结核病的价值

在南非进行的1项募集到491例痰涂阴疑为肺结核患儿的研究中，结合临床资料、胸片以及TST结果诊断肺结核的曲线下面积为85%（95%CI80%–90%）。该研究最重要的价值在于发现，T-SPOT.TB相对于临床资料、胸片以及TST的综合判断价值而言，并没有增加额外的诊断价值。

LingDI,NicolMP,PaiM,etal.IncrementalvalueofT-SPOT.TBfordiagnosisofactivepulmonarytuberculosisinchildreninahigh-burdensetting:amultivariableanalysis.Thorax,2013,68:860-866.当前第49页\共有52页\编于星期四\23点体外r-干扰素释放试验无论是HIV感染者还是非HIV感染者，IGRA的诊断效率与TST相比较均无优势。这些资料清楚地表明，在中低收入国家，IGRA和TST一样对于诊断成人活动性结核病没有任何价值[1]。另有研究指出，IGRA较低的阳性预测值限制其在中低收入国家成为临床常规检测活动性结核的手段[2]。实际上，世界卫生组织专家组基于现有的证据明确指出，在中低收入国家不能以IGAR代替常规的微生物诊断方法用于肺结核和肺外结核的诊断[3]。1.

MetcalfeJZ,EverettCK,SteingartKR,etal.Interferon-gammareleaseassaysforactivepulmonarytuberculosisd