转录组测序技术原理及应用

转录组测序技术原理及应用第一页，共五十页，编辑于2023年，星期二遗传的中心法则基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次第二页，共五十页，编辑于2023年，星期二什么是转录组？All

transcripts

All

mRNAs第三页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA是解读基因组的关键RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA第四页，共五十页，编辑于2023年，星期二测序技术RNA-SeqSmallRNA测序降解组测序Non-codingRNA测序研究对象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鉴定新分子OOOO表达谱研究OOOO基因结构分析O/XXXOEST测序O/XXXX

筛选分子标记

OOOX转录融合基因表达O/XXXXRNA测序技术第五页，共五十页，编辑于2023年，星期二WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第六页，共五十页，编辑于2023年，星期二TotalRNA样品检测

Agilent2200检测OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷伦2200TapeStation

系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。●

可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板●

快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果●

使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程●

样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品第七页，共五十页，编辑于2023年，星期二检测报告-合格样品棉铃虫/果蝇第八页，共五十页，编辑于2023年，星期二检测报告-不合格样品第九页，共五十页，编辑于2023年，星期二WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第十页，共五十页，编辑于2023年，星期二真核mRNA的纯化mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3′的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。链霉亲合素包被磁珠+生物素标记Oligo（dT）25+poly（A）第十一页，共五十页，编辑于2023年，星期二原核mRNA的纯化AmbionMICROExpressKitLNA扣锁型探针第十二页，共五十页，编辑于2023年，星期二mRNA反转录---fragment+RT纯化过的mRNA样品加入1µl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1µl的stopbuffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc糖原无水乙醇）沉淀产物。RTdscDNA第十三页，共五十页，编辑于2023年，星期二末端修复(防止自连）cDNA3′末端加AAdapter连接第十四页，共五十页，编辑于2023年，星期二第一天消化DNAmRNA的分离mRNA的打断cDNA的合成↓↓第二天末端修复↓↓加接头胶回收3’端加A第三天PCRPCR胶回收↓↓

文库制备↓↓文库质量检测：Aligent2100：片段大小、纯度、浓度qPCR：片段大小、浓度手工检测：跑胶验证。第十五页，共五十页，编辑于2023年，星期二WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第十六页，共五十页，编辑于2023年，星期二ApplicationRNA-Seq(单端测序---Quantification)RNA-Seq

(双端测序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq17第十七页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq(Transcriptome)第十八页，共五十页，编辑于2023年，星期二WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息学分析第十九页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)第二十页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文库构建测序组装第二十一页，共五十页，编辑于2023年，星期二Denovoassembleatranscriptome组装流程第二十二页，共五十页，编辑于2023年，星期二数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布）Unigene（transcript）功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框（CDS）Unigene表达差异分析（两个或两个以上样品）Unigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要内容：第二十三页，共五十页，编辑于2023年，星期二Denovoassemblytranscriptome信息分析流程第二十四页，共五十页，编辑于2023年，星期二Unigenes的GO注释第二十五页，共五十页，编辑于2023年，星期二Pathway分析第二十六页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文库构建测序比对到参考序列第二十七页，共五十页，编辑于2023年，星期二Transcriptomeresequencing比对流程第二十八页，共五十页，编辑于2023年，星期二比对统计基因表达注释基因差异表达分析基因结构优化可变剪接分析预测新转录本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要内容第二十九页，共五十页，编辑于2023年，星期二Transcriptomeresequencing信息分析流程第三十页，共五十页，编辑于2023年，星期二应用---优化转录组注释信息基因结构优化可变剪接鉴定基因融合鉴定RNA水平SNP分析第三十一页，共五十页，编辑于2023年，星期二GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution优化基因结构

鉴定新的转录本Paired-End(PE)ReadsReads比对到参考序列基因间区域第三十二页，共五十页，编辑于2023年，星期二鉴定可变剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA第三十三页，共五十页，编辑于2023年，星期二鉴定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB第三十四页，共五十页，编辑于2023年，星期二分析RNA水平SNP转录组重测序比对软件：SOAPDenovo转录组测序:组装软件：SoapDenovo比对软件：SoapSNP第三十五页，共五十页，编辑于2023年，星期二36转录组研究技术横向比较TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes第三十六页，共五十页，编辑于2023年，星期二转录组测序的优势RNA测序与芯片检测基因数比较RNA测序与芯片检测基因的表达量分布Technique1第三十七页，共五十页，编辑于2023年，星期二GenomeRes2010Case

实验材料收集：

叶片，花序,果实,根时间点：0,4,8,12,16,20和24h将每个时间点采集的样品均匀混合测序策略：

Illumina测序，1Gdata第三十八页，共五十页，编辑于2023年，星期二1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相关可变剪接第三十九页，共五十页，编辑于2023年，星期二外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低温胁迫相关的AS低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来，揭示了可变剪接有重要功能。第四十页，共五十页，编辑于2023年，星期二AS调节机制CCA1生物钟相关基因，例如调节气孔的开关等第四十一页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq单端测序（Quantification）等同于数字表达谱(DGE)第四十二页，共五十页，编辑于2023年，星期二WorkflowofRNA-Seq单端测序（Quantification）生物信息学分析第四十三页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq单端测序（Quantification）生物信息分析内容测序数据评估筛选差异表达基因表达模式聚类分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作网络分析第四十四页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq单端测序（Quantification）信息分析流程第四十五页，共五十页，编辑于2023年，星期二RNA-Seq与基因芯片优缺点比较技术优点缺点RNA-seq1）检测基因数比基因芯片多25%2）定量准，可重复性高（重复相关系数≥0.99）3）数字化信号，无背景噪音，无交叉杂交4）高、低丰度基因均可检测5）不受研究物种限制，模式生物和非模式生物均可检测6）数据可与时俱进，即随数据库更新而更新7）具有较好的分析兼容性，数据格式与芯片相同，可与芯片的分析软件兼容1）样本要求量比基因芯片多2）数据量大，需要具备一定的生物信息分析基础，才能更好的挖掘数据蕴含的丰富信息基因芯片1）平台应用较早2）信息分析软件较多3）有些平台要求样品量少1）检测灵敏度较低、重复性差、检测阈值较狭窄2）有背景噪音，假阳性率＞1%3