食品分离技术(8)-色谱分离技术

1色谱分离技术赵林1223色谱概念、原理和分类34发展历史1903年俄国植物学家MichaelTswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有碳酸钙粒子吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。45630-40年代柱分配色谱、纸色谱60年代凝胶色谱法70年代高效毛细管气相色谱法毛细管电泳、电色谱法光色谱法80年代90年代67原理流动相（Mobilephase）;固定相（Stationaryphase）;7当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。8色谱法分类按两相状态分

89按照固定相的形状分纸色谱Paperchromatography薄层色谱Thinlayerchromatography柱色谱Columnchromatography910根据分离规模分类——微克级至毫克级的样品一般用于波谱测试，如对天然产物进行的分离；——毫克级样品可用于进一步的结构鉴定，化学反应及某些生物活性测试：——克数量级的样品可用于进一步的生物活性测试，作为合成、半合成工作的原料以及标准品。——千克数量级样品用于工业生产分

析制备1011按照分配机理分吸附色谱（adsorptionchromatography）利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配色谱（partitionchromatography）利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的方法。离子交换色谱（ion-exchangechromatography）利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的方法。凝胶色谱（gelchromatography）利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。亲和色谱（affinitychromatography）利用固相载体上的配基对目标组分所具有的专一的和可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的一种分离技术。1112根据流动相固定相极性分：流动相的极性大于固定相的叫反相色谱，反之叫正相色谱。一般反相色谱由于溶剂处理比较方便，应用的比较多一些。正相色谱和反相色谱所用色谱柱的键合相也不同：目前色谱柱多用Si-O-Si-C型键合相作为填料（固定相），按极性可分为非极性、中等极性和极性三类。

非极性键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基（C18），辛烷基（C8）等，其中十八烷基键合相（ODS键合相）是最常用的。

中等极性键合相常见的有醚基键合相，可作为正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。

极性键合相常用氨基、氰基键合相，可用作正相色谱的固定相。1213色谱法的特点（1）分离效率高

复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高

可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快

一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广

气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

不足之处：

被分离组分的定性较为困难。1314色谱分离/分析系统的组成1415纸色谱以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱(毛细作用)。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置。比移值Rf＝原点中心至斑点中心的距离与原点中心至展开剂前沿的距离之比。ABCRf(B)=B/A;Rf(C)=C/A15161617薄层色谱TLC薄层色谱是利用吸附剂(硅胶,氧化铝等)对不同组分吸附能力的差异而达到分离目的的一种分离方法。薄层色谱是分离纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。171819

溶质的最高浓度中心至原点中心距离A展开剂前沿至原点中心距离BRf＝19AB20展开条件的优化在吸附色谱中，极性强的化合物会“粘”在极性的硅胶上，在薄板上移动的距离比较短。而非极性的物质将会在流动的溶剂相中保留较长的时间从而在板上移动较大的距离。展开剂的极性越大，则对同一化合物的展开能力也越大，即Rf值越大。因此，要想增大Rf值，可以改用一种极性较大的展开剂，或在原来的展开剂中加入一定量的另一种极性较大的溶剂。2021一个好的溶剂体系应该使混合物中所有的化合物都离开基线，但并不使所有化合物都到达溶剂前端，Rf值最好在0.15-0.85之间。如果为了给柱色谱分离选择洗脱液条件，则合适的溶剂应该满足Rf在0.2-0.3之间。212223强极性溶剂：DMSO〉甲醇〉乙醇〉苯胺〉乙腈〉丙酮

中极性溶剂：氯仿〉异丙醇〉乙酸乙酯〉四氢呋喃〉正丁醇〉二氯甲烷〉乙醚〉苯〉甲苯非极性溶剂：环己烷，石油醚，己烷，戊烷在戊烷和己烷等非极性溶剂中，大多数极性物质不会移动，非极性化合物会在薄板上移动一定距离。2324选择展开剂的原则：展开剂要把被分离物质从吸附剂表面解吸附，这需要展开剂对吸附剂要有亲和力，解吸附能力要适当，一般展开剂的极性应该比被分离物质略小。展开剂要能够溶解被分离物质，否则，被分离物质不能随展开剂向前移动。2425吸附剂为硅胶G，展开剂是9∶1的无水苯和乙酸乙酯的混合溶剂。最开始苏丹Ⅲ和偶氮苯被吸附在硅胶上，当展开剂通过时，由于苏丹Ⅲ和偶氮苯本身极性和在展开剂中的溶解度不同，两者在硅胶上的移动速度也就不同（一般溶解度大和极性小的移动更快），从而将混合物分开，并且可根据产生的不同比移值Rf来定性的鉴别化合物。

应用举例25薄层色谱法分离偶氮苯和苏丹III261.薄层版的制备：

取两块20cm×5cm左右的玻璃板，洗净，烘干。在80ml烧杯中，放入约10g硅胶G与CMC，加入约20ml蒸馏水，调成糊状，其稀稠为在震动下可流动，倒在玻璃板上。用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振摇、摆动，使流动的糊状物均匀的铺在玻片上（要求：制成的板厚薄均匀，无气泡。）将已涂好的硅胶G薄层板在室温下，水平放置半小时后（注意：室温放置必须使玻板干透，否则会出现断裂现象），移入烘箱，慢慢升温至110℃，恒温半小时。

硅胶玻璃板26272.点样：

样品为苏丹Ⅲ，偶氮苯及两者混合样。每块板各点三个样品一个，两块板相同。在薄层板一端约1cm处轻轻画一直线，取管口平整的毛细管，于画线处轻轻点样（毛细管刚接触薄板即可）。样点间距1cm—1.5cm，斑点一般不超过2mm（注：因溶液太稀或样点太小，可重复点样。但应在前次点样的溶剂挥发后，方可重点，以防样点被溶解掉。样点过大，造成拖尾，扩散等现象，影响分离效果）2728偶氮苯苏丹Ⅲ展开剂选用9:1的无水苯－乙酸乙酯28293.展开：展开剂—无水苯27ml，乙酸乙酯3ml。将展开剂倒入层析缸，其高度不超过1cm（注：如超过点样线，则样点将被溶解掉）。薄层色谱的展开，须在密闭容器中进行。为使展开剂蒸汽，在缸内迅速达到平衡，在缸内壁放置一高5cm，环绕周长约4/5的滤纸，或放置两张11cm滤纸，下面浸入展开剂中。将点样好的薄层板小心的放到层析缸中，点样的一端朝下，浸入展开剂中约0.5cm。2930预吸附中展开中展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛31全自动展开仪技术参数展开距离（CCD监控）：优于+1mm

干燥和循环空气流量：150L/min

湿度控制空气流量：20L/min

展开溶剂消耗：每次展开约10mL

接口：RS232/422电源、功率：85-250V，47-63Hz，30VA

尺寸：507X300X300mm3132喷雾显色箱在薄层色谱分析中，有很大一部分已展开的薄层样品斑点需要喷显色剂进行显色，有时需喷酸液进行碳化处理（然后用显色加热器或烘箱进行加热显色）。如果随意处理，显色剂或酸液喷得到处都是，残留试液腐蚀实验室设备和污染工作环境，尤其是雾化后的显色剂或酸雾无形中对分析工作人员的身心健康造成极大的伤害，因此专业的喷雾显色箱在薄层分析工作中显得非常必要。3233UV25490%硫酸乙醇343435色谱基本理论35柱色谱36363738色谱理论主要内容平衡模型塔板模型传质速率模型柱内阻力为零；分配瞬间完成柱内阻力不为零；分配逐渐完成考虑传质速率、流动状态3839基本术语流出曲线—色谱图3940基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。保留值

（1）以时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间

死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。

调整保留时间：保留时间减去死时间（tR

＇）：tR＇=tR－tM

4041相对保留值r21

组分2与组分1调整保留值之比：

r21=t’R2

/t’R1=V’R2/V’

R1

相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。峰面积A色谱峰与基线延长线所包围的面积。4142关于色谱峰的术语峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差σ43色谱分离过程当试样由流动相携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着流动相的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着流动相向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。4344分配系数（partionfactor）K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱分离的依据。4445分配比（partionradio）k

在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：

1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；4546塔板理论-柱分离效能指标色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：tR:保留时间；Wb：峰底宽度4647有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：4748塔板理论的特点和不足：(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。

(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K

相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。4849速率理论-影响柱效的因素

速率方程（也称范.弟姆特方程式）:

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；49501.涡流扩散项－A

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。50512.

分子扩散项—B

B=2vDgν

：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：a.扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差。

b.分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑

c.扩散系数：Dg∝（M载气）-1/2；M载气↑，B值↓51523.传质阻力项—

C

组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL

，液相传质阻力大于气相传质阻力。即：

C=（Cg+CL）52Df:固定相液膜厚度DL:液相中的扩散系数53载气流速与柱效-最佳流速载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效,右图曲线的右边。H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速，柱效，右图曲线的坐边。5354速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。54552.色谱分离基本方程对于常规分析工作，一般选用：选择性系数α（相对保留值）与保留指数I来评价固定液有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件以分离度R作为柱的总分离效能指标56结论：

①值很小的变化,可使有较大的变化。②值趋近于1时,它的改变对的增加R尤为显著；值较大时,对R的影响反而减少。③在k、N、三个参数中,的增加对分离的改进最有效。k从1增加3,R只增加到原来的1.5倍。N增加到原来的3倍,而R只增加到原来的1.7倍。从1.01增加带1.1,约增加9%,而Rs却增加到原来的9倍。5657分离度的表达式R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1.0：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。57583、在色谱柱加长的情况下，理论塔板数n和保留体积（时间）t都同时等倍增加，因此色谱峰宽与色谱柱长度的平方根成正比。即色谱柱长增加一倍，峰宽增加到原来的1.414倍。还记得柱长增加一倍，保留时间差增加多少么？这是速度方程的结论，增加一倍。因此分离度R在柱长增加一倍的情况下，只能增加到原来的1.414倍。即：理论塔板高度H不变的情况下，分离度R与柱长的平方根成正比。1、在色谱柱不变的情况下，即理论塔板数n和长度L都不变的情况下，色谱峰宽度与保留时间t成正比。或者说：同一次分析里，色谱峰的宽度与其保留时间成正比。因此出峰越晚，峰宽越大。2、在理论塔板数n不变的情况下，峰高与保留体积（时间）t成反比。或者说：同一次分析中，同样浓度的不同组分，出峰越晚峰高越小。

色谱理论的几个特征594、在色谱柱长度固定的情况下，即保留时间相等的情况下，色谱柱宽度W与理论塔板数n的平方根成反比。这意味着：在同样长度的不同色谱柱上，柱效率n越高，色谱峰越尖锐。通常理论塔板数n即柱效率n，但有时也把单位柱长下理论塔板数称为柱效率。由于毛细管具有极高的柱效，因此同样分析时间下，可以看到毛细管色谱峰明显要尖锐的多。

5、色谱峰高与组分总进样量m成正比。因此在进样体积一定的情况下，峰高与组分浓度c成正比，因此峰高可以用来定量。但峰高还会受到保留时间、理论塔板数n等影响，特别是当色谱峰型不正常，塔板理论不完全成立的时候，这个关系会受到影响，因此通常不用峰高定量。但无论怎么变，色谱峰面积都和进样量成正比，因此任何时候都能用峰面积定量。只有在峰型良好且尖锐的情况下，用峰高定量比较简单。

60柱色谱6061616262636364AKTAExplorer100GESweden800,000RMB制备色谱柱64652）液体固定相

组成结构：担体+固定液，前者是具有较大比表面、化学呈惰性的一类物质，后者在色谱使用温度下呈液体膜状态，化学性质稳定，不流失或挥发，主要用于分析较高沸点的有机物。对固定液的基本要求：

a蒸汽压要低，使用温度下为液体

b热稳定要好，不挥发

c惰性，与分析物质不产生化学反应。66固定液的选择原则：“相似相溶”，选择与试样性质相近的固定相。A非极性样品选用非极性固定液（主要作用力为色散力）流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性组分先流出B中等极性样品选用中等极性固定液（主要作用力为静电力）流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性小的组分先流出C强极性样品选用强极性固定液（主要作用力为静电力）流出顺序：极性低的先流出672.2.3GC检测器1）热导池检测器（TCD）属于通用型，不破坏样品

测量池参比池载气+组分载气稳压电源引线稳压电源引线钨丝与固定支架RtRc68-+空气氢气载气点火线圈收集极发射极废气出口2)氢火焰离子化检测器（FID）破坏样品，具有选择性原理：被测有机组分在高温环境中发生分解、产生碳的自由基（CH），自由基氧化产生电离，在电场中，正、负离子分别向两个电极迁移，形成电流，当电流通过测量电阻时产生压降，再进行放大处理、记录色谱图。69适用范围：它只对含C有机物有信号，主要用于有机物分析，对永久性气体，水，CO,CO2,N的氧化物，H2S,CS2,CCl4，HCOOH等没有响应，对含S，卤素，O，N,P的有机物响应很小。702.2.3HPLC的一般流程HPLC仪由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统和数据处理系统组成。712)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：723)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。734)液相色谱检测器a.紫外可见光检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

74目前主要有三种类型的紫外可见光检测器：固定波长型、可变波长型和二极管阵列式光度计。其中二极管阵列检测器能够得到每个时段的紫外可见吸收光谱，因此能进一步确认混合物中的组分，并可分析其纯度。75b.示差折光检测器除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；c.荧光检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物