山西生物职院中药制剂检验技术专题讲座：高效液相色谱法在中成药检验中的应用

高效液相色谱法在

中成药检验中的应用ApplicationofHPLCtoQualityControlofTraditionalChinesePatentMedicine学习内容和目的1.HPLC的定义、特点和类型2.色谱仪的组成及其工作原理3.药检的一般步骤和方法★★★★★★一、概述

1.高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC）系采用高压流动相，高效固定相和高灵敏度检测器的现代液相色谱法。2.HPLC的特点类型特点HPLCLC（经典柱色谱）

GC分离效能高（理论板数n）104～10510～102填充柱>103毛细管柱=106分析速度快几分钟～几十分钟几小时～十几小时几分钟～几十分钟灵敏度高（最小检出量）UVD10-9gFD10-13g样品量1～10gTCD10-8gFID10-13g适用范围宽80%有机化合物制备性分离20%有机化合物仪器化程度高智能化手工智能化HPLC特别适合分析组分复杂、含量较低的样品，在中药和中成药的检验中得到广泛的应用。历版中国药典（一部）中HPLC应用情况9169921146518105123.HPLC的主要类型及其应用类型机理固定相流动相适用范围反相键合相色谱类似反相分配色谱机理常用十八烷基键合相（C18ODS）常以甲醇－水、乙腈－水为底剂广泛，非（中等）极性成分、有机酸（碱）及其盐正相键合相色谱兼有正相分配色谱和吸附色谱机理常用氰基、氨基键合相非极性或弱极性溶剂脂溶性的极性至中等极性的分子型化合物离子色谱类似离子交换色谱机理强酸（碱）性键合型离子交换剂有机阴（阳）离子、氨基酸和糖类等手性色谱利用对映异构体与手性固定相形成的配合物稳定性的差异蛋白类CSP、多糖CSP、环糊精CSP等手性化合物的对映异构体亲和色谱利用生物分子间的专一亲和性各种键合生物特效性配基和基团配基抗体与抗原、酶与底物、药物与受体等十八烷基及其他化学键合硅胶结构示意图蒲公英图二、色谱仪及其工作原理1.贮液罐2.脱气装置3.梯度洗脱4.高压输液泵5.流动相流量显示6.柱前压力表7.输液泵头8.过滤器9.阻尼器10.进样装置11.色谱柱12.检测器13.数据处理系统14.废液贮罐超声波脱气法回流脱气法抽滤脱气法（一）脱气装置在线脱气法低压梯度洗脱（二）梯度洗脱装置高压梯度洗脱等度洗脱梯度洗脱梯度洗脱等度洗脱梯度洗脱的效果加2010输液泵图片单柱塞恒流泵串联双柱塞恒流泵串联泵工作原理（三）高压输液泵泵压：～50MPa/cm-2流量：0.1～10ml/minPURGELoadinject1.手动进样器及其进样方法（四）进样装置六通阀六通阀进样原理图loadinject2.自动进样（视频）分析型色谱柱各种类型色谱柱（五）色谱柱内径：4.6mm长度：15mm、25mm柱填料粒度：5～10μm柱温箱（室温～60℃±0.1

℃）

西洋参中人参皂苷的含测：柱温40℃参精止渴丸中葛根素的含测：柱温40℃柱温控制灯室流通池（六）检测器

紫外检测器（UVD最常用）、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器（DVD）、蒸发光散射检测器（ELSD）和质谱检测器（MS）等紫外检测器外观图

UVD光路示意图加监视器图（七）数据处理系统色谱工作站（八）色谱仪工作原理(flash)

（九）操作注意事项

1.流动相需用微孔滤膜（0.45μm）滤过并脱气才可使用。

2.开泵后，先打开冲洗键（PURGE）进行泵排气。然后将流动相接入色谱柱充分冲洗平衡，待基线稳定后方可进样。

3.测试溶液需用微孔滤膜（0.45μm）滤过。

4.使用键合硅胶柱，流动相的pH值应控制在2～8，否则色谱柱很容易损坏。

5.由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于使用C18柱的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％。否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值的改变，造成色谱系统的不稳定。

6.工作完毕，应先后用水和甲醇充分冲洗液路系统，尤其是使用了含盐的流动相，更应充分冲洗。

1.药品检验大多采用____HPLC。（A.正相键合相B.反相键合相）2.反相键合相HPLC常用____柱（A.C18B.C8），常以___为流动相（A.甲醇-水

B.乙腈-水C.苯）。

3.最有效的脱气方法是____（A.回流法B.抽滤法C.在线脱气法D.超声波法）。

4.洗脱方式有____（A.梯度洗脱B.等度洗脱C.差度洗脱）。

5.常用的高压输液泵为____（A.恒压泵B.串联双柱塞恒流泵C.单柱塞恒流泵）。

6.进样器有____（A.注射器B.六通阀C.自动进样装置）。

7.最常用的检测器为____（A.ELSDB.MSC.DVDD.UVD）。（十）小结三、HPLC在药检中的一般步骤测试溶液制备系统适应性试验数据处理样品测定结果判断

（一）测试溶液的制备

按各品种项下规定制备对照品溶液和供试品溶液。操作应严格规范，定量取样、提取、纯化、转移和稀释，避免“跑、冒、滴、漏”。1.对照品溶液的制备对照品对照品溶液的定容2.供试品溶液的制备粉碎（分散）样品精密称定连续回流提取超声波提取水蒸气蒸馏过滤固液萃取定容液液萃取

（二）系统适应性试验

▲采用药品标准规定的对照品和条件对色谱系统进行试验考查，包括色谱柱的理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四项指标。其中分离度和重复性更具实用意义。

▲用于药品检验的色谱系统，应符合药典对系统适应性试验的规定。否则应对色谱条件作出适当的调整，使其达到有关规定。

▲各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变,

以达到系统适用性试验的规定。1.色谱柱的理论板数（n）考察柱效

n值越大柱效越高tR

保留时间Wh/2

半高峰宽★牛黄解毒片中黄芩的含量测定理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。★藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定理论板数按厚朴酚峰计算应不低于5000。

2.分离度（R）

考察分离效果

R值越大分离效果越好在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定外，应大于1.5。

3.重复性

考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0％。RSD计算公式

份号12345A20617.2519663.0719543.3020412.4119254.30例题取某对照品溶液10μl，连续进样5次，记录各次色谱峰峰面积如下，试判断色谱系统重复性是否符合规定。X=19898.1S=586.789RSD=2.9%不符合规定—

4.拖尾因子（T）

考察色谱峰的对称性T值越接近于1.0

色谱峰的对称性越好，测量的准确度越高。采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。W0.05h为0.05峰高处的峰宽d1为峰极大至峰前沿之间的距离

（三）上机测定按规定分别精密吸取一定量的对照液和供试液，注入色谱仪测定，记录色谱图和有关数据。（四）数据处理和结果判断（1）利用保留时间（tR）进行定性鉴别（2）利用峰高（面积）进行含量测定（3）利用特征峰的相对保留时间和峰面积比值等参数对药品进行指纹图谱鉴定

四、HPLC在药品检验中应用

（一）定性鉴别（保留时间比较法）1.原理

在同一色谱条件下，相同的成分具有相同的色谱性质和色谱行为，其色谱峰也就具有相同的保留时间。因此比较供试品色谱图和对照品色谱图，若前者中某一色谱峰的保留时间与后者色谱峰保留时间相同时，即可判定供试品中存在某种成分或某种药味。所谓保留时间相同是指基本相同,彼此相差百分之几秒是允许的。

2.实例百令胶囊的鉴别

本品为发酵虫草菌粉（CS-C-Q80）制成的胶囊。中国药典收载了TLC鉴别法和HPLC鉴别法等，在此仅介绍核苷类成分的HPLC鉴别法。该法采用了先进的梯度洗脱法，并以腺苷等多个组分为指标进行鉴别。

尿苷腺苷（1）色谱条件：C18柱，检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低于3000，以乙睛为流动相A，以0.04mol/L磷酸二氢钾为流动相B，按下表进行梯度洗脱：时间（分钟）流动相A（％）

流动相B（％）0～1515～4500→15

100100→85

（2）腺苷对照液制备取腺苷对照品适量，加0.5％磷酸溶液制成每1ml含12μg的溶液，即得。（3）尿苷对照液制备取尿苷对照品适量，加10％甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得。（4）对照药材溶液制备取发酵虫草菌粉（CS-C-Q80）对照药材0.5g，照供试液制备方法制备。

（5）供试液的制备

内容物（0.5g）

置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，密塞，浸泡30分钟，滤过，弃去乙醚，挥干。连同滤纸一并置具塞锥形瓶中，加入0.5％磷酸溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.5％磷酸溶液补足减失的重量，摇匀。静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。残渣供试液（6）测定法

分别吸取上述四种测试溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。除溶剂峰外，供试品色谱应呈现与对照药材色谱保留时间相同的六个主色谱峰，与腺苷、尿苷对照品保留时间相同的色谱峰。腺苷尿苷25214356对照药材样品

（二）含量测定（外标法）1.原理

在一定浓度范围内，被测成分的质量与其峰面积或峰高成线性关系。因此，可根据被测成分峰面积、对照品峰面积和对照液浓度，求算出供试液中被测成分的浓度。再根据稀释倍数、取样量等参数，即可计算出被测成分的含量。2.计算步骤（1）计算供试液中被测成分的浓度（2）计算药品中被测成分的含量=A供A对C供Ｃ对因为：C供（μg

/ml）=C对×A供A对所以：含量（g/g%）C供（mg/ml）×稀释倍数×样品溶液体积（ml）取样量（g）×100%=3.实例藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定本品由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷等十味中制成的液体制剂，每支装10ml（标示装量）。其中厚朴为要药之一，故《中国药典》采用HPLC，以厚朴酚及和厚朴酚的总量为指标，控制厚朴的含量。厚朴酚和厚朴酚（1）色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-水（50:20:40）为流动相；检测波长294nm。理论板数按厚朴酚峰计算应不低于5000。（2）对照品溶液的制备

厚朴酚对照品适量甲醇溶解对照品溶液（0.2mg/ml）和厚朴酚对照品适量甲醇溶解对照品溶液（0.1mg/ml）（3）供试品溶液的制备样品5ml供试液加盐酸2滴氯仿振摇提取（10ml×3）氯仿蒸干甲醇溶解精密稀释至10ml甲醇液精密吸取5ml，置10ml量瓶中，加乙醇置刻度摇匀（4）测定法

精密吸取上述三种溶液各10μl，分别注入液相色谱仪测定，根据对照品的峰面积（AR厚、

AR和）以及供试品中被测成分的峰面积（AS厚、

AS和）计算厚朴的含量。本品每支含厚朴以厚朴酚（C18H18O2）及和厚朴酚（C18H18O2）的总量计，不得少于5.8mg。

对照品色谱图供试品色谱图【含量计算】

①分别求算供试液中厚朴酚、和厚朴酚的浓度（mg/ml）

C对为厚朴酚或和厚朴酚对照溶液的浓度；A供为供试品中厚朴酚或和厚朴酚的峰面积；A对为对照品厚朴酚或和厚朴酚的峰面积。

②分别求算药品中厚朴酚、和厚朴酚的含量（mg/支）含量厚（mg/支）＝C供厚（mg/ml）×10ml×10ml×标示装量（ml/支）5ml×5ml（取样量）含量和（mg/支）＝C供和（mg/ml）×10ml×10ml×标示装量（ml/支）5ml×5ml（取样量）③求算厚朴酚与和厚朴酚的总量含量厚（mg/支）+总量（mg/支）＝含量和（mg/支）（三）中药指纹图谱鉴定

1.中药指纹图谱鉴定（fingerprinting）是以中药及其制剂有效部位的大部分成分，或全部特征性成分为指标，应用HPLC等现代分析技术对样品进行测试。然后根据一系列特征峰的相对保留时间和峰面积比值等参数，对药品的真伪优劣进行评价。

2.中药指纹图谱鉴定不同于常规的理化鉴别和含量测定，它强调的是对药品质量进行整体性的描述和评价，这完全符合中医药整体学说。因此，中药指纹图谱的建立和应用，对于提高药品质量，促进中药现代化具有重要意义。

3.实例银杏叶提取物的检查现行中国药典在银杏叶提取物品种检查项下，采用了HPLC指纹图谱技术，对该药品的品质进行评价。（1）黄酮苷元峰面积比限度检查

按总黄酮醇色谱计算槲皮素与山奈素的峰面积比应为0.8～1.5

①测试条件C18柱甲醇-0.4％磷酸溶液（50︰50）为流动相检测波长为360nm理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500

②槲皮素对照液的制备

精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含30μg的溶液，即得。

③山奈素对照液的制备

精密称取山奈素对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含20μg的溶液，即得。④供试液的制备

加甲醇-25％盐酸溶液（4︰1）混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温。【水解】水解液移至50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液，即得。供试液取样品约35mg⑤测定法

分别精密吸取对照液和供试液各10μl

，注入液相色谱仪测定，以对照品色谱峰的保留时间确定供试品色谱图中槲皮素与山奈素的色谱峰，求算二者峰面积之比（A槲

/A山）。BC槲皮素山奈素样品（2）总银杏酸限量检查①色谱条件C18柱甲醇-0.4％冰醋酸溶液（90︰10）为流动相检测波长为310nm理论板数按银杏酸C13︰0峰计算应不低于4000②银杏酸C13︰0对照液制备

精密称取银杏酸C13︰0对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含5μg的溶液，即得。③总银杏酸对照液制备精密称取总银杏酸对照品适量，加甲醇溶解制