生物样品前处理详解

生物样品前处理详解演示文稿当前第1页\共有27页\编于星期四\19点优选生物样品前处理当前第2页\共有27页\编于星期四\19点第一节样品分离的预提取第二节细胞的破碎与分离第一章绪论3第二章生物样品前处理当前第3页\共有27页\编于星期四\19点第一节样品分离的预提取（前处理）前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进行去除；

2.1.1概述预处理材料的种类和特点

动物细胞反应液植物细胞反应液微生物细胞反应液植物组织提取液动物组织提取液“发酵液”“产物”，胞内or胞外？组织4第二章生物样品前处理当前第4页\共有27页\编于星期四\19点2.1.2植物组织提取物的制备植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。叶片、根、茎——清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4°C——-30°C低温保存备用）；种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等——泡涨，粉碎。5第二章生物样品前处理当前第5页\共有27页\编于星期四\19点一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。2.1.2.1植物组织中酶的提取6第二章生物样品前处理当前第6页\共有27页\编于星期四\19点例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1.步骤：100g新鲜叶片→切成小片（打孔器、切片）→置入提取液中（稳定酶活性）→PVPP预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）→间歇高速搅拌（充分接触混匀）→纱布过滤→滤液加入PVPP重复轻搅（重复一次）→离心去除PVPP→酶粗提液。7第二章生物样品前处理当前第7页\共有27页\编于星期四\19点2.条件讨论低温（4～5度），器皿、溶液预冷、操作要快；5～7倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）；PH6.5~7.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点；PVPP优良，不溶性；PPO抑制剂，DTT、2-ME；蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。8第二章生物样品前处理当前第8页\共有27页\编于星期四\19点2.1.2.2多糖提取重要活性多糖步骤：原料→粉碎→醇醚回流脱脂→水提取→粗提液去蛋白策略：Sevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性TCA法，低浓度的TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。9第二章生物样品前处理当前第9页\共有27页\编于星期四\19点2.1.2.3细菌重组蛋白的提取重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。10第二章生物样品前处理当前第10页\共有27页\编于星期四\19点例：E.coli.中提取重组蛋白1.步骤：酶解菌体细胞：离心收集菌体→溶菌酶→去核酸（DNaseⅠ）→电泳检测；清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；溶解包涵体：释放目的蛋白；目的蛋白再折叠：恢复活性11第二章生物样品前处理当前第11页\共有27页\编于星期四\19点第二节细胞的破碎与分离微生物代谢产物：胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）胞内产物（大多数蛋白质、类脂）微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。2.2.1概述12第二章生物样品前处理当前第12页\共有27页\编于星期四\19点2.2.2常用破碎方法机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等；对物料的挤压和剪切作用非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；13第二章生物样品前处理当前第13页\共有27页\编于星期四\19点2.2.2.1珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝d<1mm）一起快速搅拌，细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。玻璃珠（石英砂、氧化铝等研磨剂）+细胞悬浮液→研磨→释放胞内物14第二章生物样品前处理当前第14页\共有27页\编于星期四\19点破碎过程产生热能，要注意热交换，温度控制——夹套冷却，实验室预冷器皿；适用于绝大多数微生物细胞的破碎高破碎率，但难以实现固液分离，浆状特点：15第二章生物样品前处理当前第15页\共有27页\编于星期四\19点高压匀浆器；细胞悬浮液受高压作用→快速从针形阀射出→经历剪切、碰撞、高压至常压变化后导致细胞壁和细胞膜的破坏→释放胞内物2.2.2.2高速匀浆法原理16第二章生物样品前处理当前第16页\共有27页\编于星期四\19点特点增大压力和破碎次数，对于高浓度的细胞或难破碎的细胞常采用多次循环操作的方法30～60Mpa最佳易造成堵塞的团状或丝状真菌不适合较小的革兰氏阳性菌（细胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不适合17第二章生物样品前处理当前第17页\共有27页\编于星期四\19点2.2.2.3超声破碎法可听波（次：地震、海啸）20~20KHz（超）。空化现象指超声波在传播过程中与组织中的气核或微气泡相互作用，使其突然爆破，产生巨大的瞬间压力，从而改变组织结构的现象。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎工作原理18第二章生物样品前处理当前第18页\共有27页\编于星期四\19点适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加冷水）工作频率25～130KHz功率正比于破碎效果细胞浓度低有利于空化泡的形成及爆破，破碎效果好于粘稠液不同的微生物需采用不同的破碎参数（功率、破碎时间、间隔时间、循环次数），G->G+>酵母。易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由，基因使敏感活性物质失活），可加入保护剂N2、PMSF等特点：19第二章生物样品前处理当前第19页\共有27页\编于星期四\19点溶菌酶（细菌），β-3，3-葡聚糖酶，β-1，6-葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶），酵母。酶有专一性。特点：条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置）价格高，限制了大规模应用通用性差，不同菌种需选择不同的酶，最佳条件不易确定；产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖→蛋白酶，葡聚糖→葡聚糖酶2.2.2.4酶溶法外加酶20第二章生物样品前处理当前第20页\共有27页\编于星期四\19点将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。自溶法21第二章生物样品前处理当前第21页\共有27页\编于星期四\19点2.2.2.5化学渗透法原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。22第二章生物样品前处理当前第22页\共有27页\编于星期四\19点表面活性物质：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎EDTA螯合剂：与结构中ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破裂有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细胞破碎；变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水23第二章生物样品前处理当前第23页\共有27页\编于星期四\19点特点选择性释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%；有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。24第二章生物样品前处理当前第24页\共有27页\编于星期四\19点将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。2.2.2.6反复冻结——融化法原理：25第二章生物样品前处理当前第25页\共有27页\编于星期四\19点使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥干燥法26第二章生物样品前处理当前第26页\共有27页\编于星期四\19点