检验核医学：受体的放射配基结合分析法

受体的放射配基结合分析法

(RadioligandBindingAssayofReceptor,RBA)生命活动的物质基础：生理、生化反应生物活性物质通过受体介导发挥作用（信息传递）包括：激素、神经递质、生长因子、药物、毒物、抗原受体功能异常与疾病受体信息传递与药物研究受体研究历程

1889J.N.Langley:receptivesubstance

PaulEhrlich:receptor

30年代A.J.Clark:占领学说(occupancytheory)

50年代：E.J.Ariens:内在活性(intrinsicactivity)

R.P.Stephenson:效能(efficacy)

60年代受体的I-125、H-3示踪技术

70年代EarlW.Sutherland：第二信使学说

Lefkowitz、Goldstein等：受体放射配基结合分析技术分离配基受体复合物放射配基+受体分子测定受体数量和亲和力定性RBA

通过配基与受体反应的量效关系及某些参数的变化等来判断受体的类型，单位点或多位点系统,受体与配基相互作用的特点(可逆或不可逆，合作作用)。定量RBA

在已知配基与受体反应性质的基础上，通过结合反应给出一定组织或细胞中能与该放射配基结合的受体数称结合位点数(numberofbindingsites)一RBA的有关基本慨念

１受体(receptor,R)

存在于机体靶组织细胞上能与激素或药物，生理介质等特异结合从而引起整个生物效应的特定的接受点(结合位点)。２配基(ligand,L)

能与受体特异结合(即具高亲和力)的化学物质统称为配基。激动剂拮抗剂内源性配基３受体与配基的结合反应

简单单位点系统：受体与配基结合的系统中只存在一种结合位点，即各个受体分子表现出完全相同的结合特性和生物效应，而且配基和受体分子以１：１的关系结合，各受体分子间不表现明显的正或负合作2.受体与配基的结合反应

饱和曲线

将待测的标本与标记配基在一定的条件下进行结合反应。标记配基的浓度从低浓度到饱和浓度具多个实验点；以标记配基的浓度为横坐标，复合物的量为纵坐标即成饱和曲线。通过饱和曲线，可以求出KD及Bmax值。

两种实验方案：多点法(饱和曲线)、单点法

两种实验方案的比较

放射配基浓度优点缺点用途单点法单个饱和浓度操作简单只能求出Bmax临床检验样本量少误差稍大(偏小)药物筛选

多点法从低到饱和浓可以求出Kd操作繁琐,工作受体理论研究度(7～10个点)Bmax,可信度高量大,样本量大检验反应性质

标记配基的选择

常选择与受体结合亲和力和特异性特别高的标记配基，而不一定是受体的生理激动剂要求：性质:与受体结合具高亲和力，高特异性比活度大于30Ci/mmol(1.2TBq/mmol)放化纯度大于95%具化学稳定性

3H-E2纯化前后对NSB的影响(DPM)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━纯度(%)浓度(nmol/L)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━0.41.02.13.7━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

85.4(纯化前)51212142708404398.3(纯化后)37482720932836━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━非标记配基的选择

性质与标记配基不一定属同一化合物，但必须两者能竞争同一受体，并且非标记配基与受体的特异性亲和力应尽可能高，浓度非标记配基在反应系统中的浓度应达到标记配基浓度的１００倍以上(100～2500)，使绝大多数受体都被它占领而不再与标记配基结合标本采集、保存及处理方法

一标本为兔子宫内膜，用3H-E2测定胞浆中ＥＲ的含量。新鲜标本的ＥＲ含量为51.39±5.57fmol/mg蛋白。

标本保存温度及时间对Bmax的影响(fmol/mg蛋白)

保存方式1w2w3w4w

液氮48.32±5.1246.37±2.1040.08±3.2734.15±6.13-40℃46.10±4.3334.58±4.2925.59±5.4021.03±3.91

3.分离方法

目的分离方法的要求低NSB、有效性、快速常用分离方法

DCC法、离心法、过滤法ＤＣＣ法(葡聚糖包裹活性碳吸附法（Dextran-CoatedCharcoalDCC)

基本原理：在ＤＣＣ悬液中，活性碳被葡聚糖包裹，形成起着分子筛，未结合的、小分子的游离配基(Ｆ)进入并被吸附，而结合的大分子复合物(Ｂ)则不能进入而被排斥在外，经过离心，复合物从上清液中获得。离心法方法：将达到平衡后的反应液通过离心，将留于上清液中的游离配基倾去，经反复离心洗涤２～３次后，便可达到分离的目的。过滤法方法：将反应液滴于玻璃纤维滤膜上，在持续负压下抽滤。同时用不含配基的冷冻缓冲液淋洗滤膜２～３次，即可以将游离标记配基除去。整个抽滤过程应在０～４℃的条件下完成，并在分配时间内完成，以免受体－配基复合物解离。分离过程中最大的容许时间为0.15t1/2。因此确定分离时间，主要取决于其平衡解离常数KD值

分离时间的确