操纵酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程

利用酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程摘要：本研究对香菇在273K、283K和293K条件下密闭容器中的氧气和二氧化碳随时间浓度变化进行了测定，通过酶动力学原理和利用非线性估计法、多重回归分析分别获得气体成分的变化率曲线和米式方程，从而获得相应参数，求得反映呼吸状态的呼吸熵动态变化规律以及温度影响参数—活化能，这样就可以求出在任意温度、有氧呼吸气体环境条件下果蔬的最大呼吸速率，为气调包装系统设计提供必要依据。关键字：酶动力学原理非线性估计法多重回归法米氏方程呼吸熵活化能香菇Lentinasedodes(Berk)sing，又叫香菌、冬菇，属白蘑（口蘑）科香菇属，为食用菌类蔬菜，在蔬菜中属于呼吸强度较大的一类品种。植物活体的呼吸总方程式为：植物体贮藏环境中氧气以及二氧化碳含量直接影响到植物体的新陈代谢，呼吸速度越快消耗体内的糖分等物质就越多,鲜度下降就越快。植物的有氧呼吸涵盖了一系列的酶催化反应，其中包括葡萄糖酵解到丙酮然后通过三羧酸（TCA）循环获得产物CO2[1]。因此，有效的气调包装能抑制香菇的呼吸速率及新陈代谢作用，延缓衰老达到保鲜的效果。呼吸强度是设计气调包装方案的重要指标参数，影响呼吸强度的因素有许多，如温度、湿度、二氧化碳浓度、氧气浓度和时间等。这些参数将为包装膜透气率的计算和选择提供理论基础。本研究延承了Leeetal.（1991）[2]的三维参数模型—时间（t）、氧气浓度（O2%）和二氧化碳浓度（CO2%）浓度之间的相互关系，建立酶动力学方程即Michaelis-Menten方程，同时考虑三种参数影响，得到香菇呼吸模型，为气调包装参数的选择提供理论基础[3]。1材料与方法1.1材料香菇采购于上海杨浦区渭南路农贸市场，选取菇型圆整、菇柄正中、不开伞，卷边整齐，无病斑的香菇为实验材料，并进行清洗、沥干处理，实验前将香菇在预设的三种温度（293K、283K和273K）下贮藏5个小时直至达到实验所需温度。1.2仪器103层析仪[色谱柱为：Porapak-Q柱（60~80目）+13X（60~80目）：上海仪器厂1.3主要实验方法1.3.1密闭实验设置实验通过初始条件即O2：21%；CO2：0.0%，将一定质量的香菇放于一定体积的玻璃容器中，瓶底装入干燥剂（一定量的硅胶和CaCl2（s））以控制体系湿度，因为湿度会影响到贮藏样品的水分活度，水分活度的大小直接影响到生物体代谢快慢，这就会对体系氧气和二氧化碳的浓度变化有较大影响[4]。其次，将瓶口用橡皮塞和真空封泥密封后（橡皮塞上有一φ8mm的小孔，用φ15mm×5的硅胶垫密封），置于一定的水浴或冰浴中待温度恒定，然后每隔0.5-1.0小时用注射器量取0.5mL气体成分注入层析仪进行检测,平行检测两次，同时记录下O2、CO2对应检测的峰高，计算出对应体系中的百分含量。层析仪中参数设置为载气：99.995%N2；流速15mL/min；柱温：40℃；检测器：TCD，温度：80℃；进样温度：40℃；定量方法：外标法。每组实验的设置见表1：表1香菇呼吸密闭体系环境设置Table1Thedesignofclosedsystemmethodofthreedifferenttemperatures摄温度下（确K选）响273潮283床293扫香菇质促量飘（驻g犁）笨180牺.9疑295陪281限.6旧容器体部积局（堂L纯）返1迹2晨2飘空隙体闭（秘L犁）些1.2双2线0.8世9举0.7就5脾处理条捡件姻冰浴夸恒温水蓝浴寻恒温水械浴1.3.2密闭容器中的呼吸速率方程的拟定由于各类蔬菜的品种和个体差异较大，呼吸环境中氧气、二氧化碳浓度随时间的变化也千差万别，所以历来文献都没有参照统一的方程来描述气体浓度随时间的变化。依据米氏方程的Lineveaver-burk曲线图可知呼吸化学方程在初始阶段反应速度维持恒定即呈线性，但随着时间的增长，曲线的斜率变化速度减少，反应速度趋向一恒定值，因此，简单的直线方程并不能真正地表达浓度与时间的关系，气体浓度随时间变化的曲线呈弧线形，并无限趋近一定值，将所有的参变量（rO2，rCO2）和应变量（[O2]，[CO2]）同时表示成时间（t）的函数，通过上述推论以及结合STATISTICS软件中的非线形估计法[5]（NonlinearEstimation），选取损失函数（L）值最小（损失函数（L）=（观察值（OBS）-预测值（PRED））2），复相关系数(MultipleR)接近于1的公式作为反映不同温度下香菇在密闭容器中气体浓度与时间的关系式：[1][2]其中，氧气和二氧化碳的浓度（[O2]，[CO2]）以百分数%表示，时间t以小时（hr）计算。因此，根据式[1]、[2]可以得出d[O2]/dt以及d[CO2]/dt：[3][4]粘则呼吸饥速率为偏：[5][6]宣式中朱，它r索—龄呼吸速覆率（氧弱气的消晨耗率或伍二氧化鉴碳的产傅生率）季（椅mg/捆k序g敏﹒向h检r竹）；暖M写O2/严CO2甘—智氧气或贪二氧化缴碳的摩世尔质量蔑（备g/m盟o片l略）；绑V搂—吨空隙体凯积彩，畜L距；违W票—肤密闭体饶系中香悬菇的重建量甜，蹦g栋；序P爽—备体系压衣强阿（件P晃a孝）；历R壤—判理想气斑体常数哥（改8.3餐14J守/mo诉l烘﹒听K阿）；笼T只—轿开氏温范度卧（食K返）。衰1.3针.3呜Mic任hae吗lis拴-Me值nte捐n疼方程的虑确瓜立坚形依据酶蜂动力学杆呼吸模笋型评[4]杂要求体渔系保持倡有氧呼暮吸状态救即傲[O范2麦]>1厕.5挣%循或由[CO描2唇]<2箱0疮%湿才是有受效的之[6]及，氧气德过低或絮二氧化借碳过高就将导致供香菇无难氧呼吸乐，则不累符合米就氏规律作。在本圈次实验熊中同时谈测定了胁单位时劳间内底察物（氧渣气）的泽消耗量刃以及产谷物（二低氧化碳地）的生躁成量。允其中二指氧化碳撕又是化责学反应菠的非竞幅争性抑去制剂，皆因此，唇依据米名氏方程汪的非竞掀争性作券用的速接度方程荡为如下坡公式：[7][8]磨式中冷，的V倡m模、役K托m样和跃K疼i磨—玩调整因耻子；双V绝mi叮—分最大反迅应速率士（氧气红消耗的勉最大速仇率或二翻氧化碳零产生的况最大速航率）律（椅mg/店k谅g能﹒鉴h麦r栋）；租K讯mi友—根表观米测氏常数搭（妨%板）；埋K泻i矛—害抑制系抹数笛（俯%宏）。般通过实古验所测卫结果利露用渴STA地TIS推TIC闷A懂软件进蝶行多重欣线性回倒归分析歼求得其晶值。矩而沿r若CO2轻/胞r耀O2清的值就晓是呼吸建熵公（赶R斩Q安）醉[7]弊，它是催表现氧浪气与二肚氧化碳贪共同作馒用下香仔菇呼吸却状态的架动态因假子，也参是定性掌代谢途饱径以及斧表征脱能羧酶或网氧合酶烫系统的茅一个有腾效参数陪。本次购实验中田要求体尖系维持宁在有氧溜呼吸状扛态，所榜以通过敏计算补，捆R偏Q身应该小酷于或接北近袜于瓶1司，贝即醋r再CO2竖≤摇r怎O2哄。责1.3缩.4泪夺温度对锦香菇呼立吸作用径的影耻响设尤氧气和视二氧化劣碳的变养化率除析了受浓惊度、酶望等因素劈的影响良，最关其键的是茅受到温雹度的影铃响，在睡求得了割不同温沃度下氧畜气和二解氧化碳芽的最大提变化率摆（检V纺m帅）后，邮通东过飞Arr遣hen伯ius屠[8]蹄关系齿将牙1/起T蚀与击LnV邻m脊进行线酷性回归票，其斜触率值堪为萄Ea/社R庸，吊E狐a箭（灿kJ/府mo疲l卡）就是馆活化能氧，由此绿可推算穿其他温哪度下香治菇呼吸价作用的我最大呼甚吸速率胶，其预盗测方程霜为：烫[9]滥衔式中着，希V邪m0忧—厚已知的羞氧气最也大消耗价率或二箭氧化碳站的最大却产出率激（镰mg/木k是g圾﹒撇h耀r缴）；绳T辈0粥—字已知的宾温度袍（痰K竭）；栋V罗m房—杆T胀温度下设的氧气伤最大消洪耗率或纵二氧化库碳的最秘大产出队率诉（态mg/桑k懂g穷﹒鼻h织r岂）。妥2强结果与话分析杨2.1般腐不同温员度下香苦菇在密仙闭体系得中气体庄浓度函挽数的确桑定穗各个温养度下的苏氧气和舟二氧化层碳随时或间的变论化的回谅归方程梨见敞表道2杆。尾由北表海2描可以看鹅出由实摩验数据我拟合出题的曲线悲有较好符的吻合吹性，从自而得出附各个温矿度下以林时间为咬自变量裁，氧气练与二氧疗化碳浓盛度为应搅变量的许方程式姓。拾表腥2些茅氧气、裙二氧化该碳浓度妇随时间反变化的肤非线性育回归方醉程砌Tab脆le送2N傻onl滤ine师ar伤est傍ima匀tio昏nr增egr霜ess吃ion著of淹O笔2别,CO乒2无cha报nge给wi弱th育tim取e订温浩度逃K静非线性乔回归估夏计方程侨损失函植数吼（糕Los驴s听）乐复相关具系数趋（吸Mul贱tip帝le怜R阁）绳293鸭9.7佳7营0.9参93多3.5森6恩0.9味88动283顽9.6革0某0.9钱87秧6.3捎7奴0.9砖93垒273豪10.眼89申0.9效87汽5.2包1陈0.9订63栽2.2给Mi该cha勒eli们s-M庄ent要e诱n雾方程及贿各参数尾的确立未在求得禽了各个得温度下伶氧气和剂二氧化炮碳浓度唐与时间虹的拟合多方程后禽，就可拘以根据始公判式交[5]爬~[8顾]贪，求得滨氧气的戒呼吸消滋耗速遇率得r掩O2秩和二氧聪化碳的拾呼吸生付成速律率甩r喷CO2果，拟合滥曲线见迅图勾1奶；根据脊公猾式铁[7远]揪、赌[8治]冰通过多狡重线性疫回归分鞭析，获蔑得酬表小3销结果：症表乎3则陪香菇熊在够273肚K压、泰283牲K午和仙293颜K陵下根据想多重回售归求得镰米氏方房程各参肢数等值炊Tab跟le矮3Es敌tim检ate职dv刺alu隐es涌for鹊Mi腹che据ali分s-M结ent楼en借mod俯el浇of热shi搭ita超ke遮in估273苏K,2块83K努an绝d2毅93K笔de胡ter普min辟edb币ym尝ult欺ipl泉el唯ine裁ar寿reg疤res重sio毛n杰温方度耳K葵K仪m河%O2版V慈max航mg/文k匠g驶·监hr献K累i廉%CO痕2坝R喘2烧标准误违差贝（无Std缠.Er裤ro灭r超）伪293快0.2托7俗981病1.3尖3氏0.9蚁85佛0.0改059典0.2银3棕828卫1.5川8绘0.9帮85州0.0抄000溉34燕283毛0.4鲜743君2.8均6沃0.9可89间0.0芦60青0.1吐4委314厌8.2锤0纲0.9绍89哈0.0除000谦38何273掏0.0廉5套117因8.1挑1艰0.9挺73引0.2婶2顷0.0河17惩57.汗4绣23.专58许0.9场73丙0.0戏001可5涛注踏：套2军、谋4滥、恰6伐行数据彼由公暴式炮[7所]轰求得秤，造3盟、航5塘、喇7薯行由公尸式具[8弦]攻求得。哨表米3早中，每孟组方程蚂各项的斥标准回分归化系小数蜘（井BET卷A比）在软服件中显池示高亮来度（雄即栏P-l开eve混l<0积.0钩5叛）说明灾线性显刻著。括在妙293搅K限条件下缓，香菇膀的由始垮至终呼看吸熵蓬在膏0.8妥6~1端.0位2承之间变案化，其未中，当祥氧气浓醋度核在济1.0司%司和二氧抵化碳浓名度劈在乡13.拳4葡%转条件下它呼吸熵骡约常为会1惜；迅在顷283振K咐条件下虾，香菇臂的呼吸扩熵际在夏0.4饮~1.倚6支之间变干化，当渗氧气浓伸度斤为哥5.2角%腰和二氧僻化碳浓少度病为消7.2矿%逼，披R弊Q耕约敞为带1进；简273稿K身条件旨下蝇R议Q乱区间却为胃0.4俭~1.当0渗3镜，当氧亮气浓度随为转0.7蚕%雨和二氧至化碳浓盈度肉为栗8.4机%亡，牧R肠Q验约笔为晨1鸦。由此息表明本拼实验是枕在有氧吼呼吸的夸条件下椒进行的轮，计算青有效。检2.3哗择温度对汤香菇呼晶吸作用灶的影响沫三个温速度讽下咽LnV飘m括的值统计计见糖表兰4骂：猾表嗓4冶拆不闭同刮1/州T徐下净，盖LnV猴m袍女的闸值窃Tab伞le笼4T枕he勤val围ues夕of经Ln村Vm贴in揭dif掀fer律ent萄1/叛T雨1鞋/传温度堪（听K齿）浩1/2胃73啄1/2哲83乞1/2础93踢LnV尚m1汪4.7宋6贱6.6垫1携6.8可9首LnV凉m2跪4.0肌5权5.7遇5勤6.7昼2骄不碑同屯1/氧T贤下红，挖LnV鬼m夸线性回食归预测溪值与观小察值关嫂系中氧知气斜筛率竭=-0仍.9狠3剩，复相胀关系尘数惰=0.两92规7宿；二氧统化碳斜跌率陷=0.倦9邻9康，复相势关系姜数魂=0.诊99爬0辩。即通过计表算求得志的在氧槐气最大犁消耗率烫活化能炮为剥7.7善3kJ休/mo苹l翅；二氧淹化碳最食大产生龄率的活案化能胜为着8.2贫3kJ财/mo莫l夫。根据泉公摩式细[9塔]冻，在已嚷知一定获温度下刷氧气的剧最大消哪耗速率胳或二氧改化碳的霜最大产蛮出率，瞧就可以馆求得其狱他温度研条件下唉的最大勇变化率殊。例如咏：在有剧氧呼吸画条件下艇，已知恒香菇嘉在匙273躺K孙下氧气浮的最大亩消耗率秆为弟117光mg/运k较g芽·刑h存r苍，根据居公庭式才[9鲜]泰代入相父关参数植值可求制得是在旗288长K洪下氧气鞋最大消劲耗率瓶为冲139厅.7镰mg/府k西g短·疏h安r钟。创3兼结果与功讨论倡本次实背验利用璃米氏方轿程机理饶，选取年了具有什一定特柔征的函思数形式踢，拟合抵了一定志温度下裁氧气、业二氧化肯碳浓度篮随时间捏变化的墓方程，悬并且复缠相关系斗数都达佣到摔了执0.9举5美以上。飞米氏方钱程的各勉个参数惩值为进咐一步气滤调包装离的参数谱设定提莫供理论刘依据，营并且方私程原始君模型仍般为时间域的函数基，大大围简化了踩由于呼举吸作用遵而导致址体系的扯复杂性贼。实验贸中同时衔也获得州了对呼添吸熵的捞动态变凤化。红温度因异子对香蠢菇呼吸才作用的粱影响则猴通裙过魄Arr记hen长iu怀s贡关系求枪得抄E前a固，同时零求得在极有氧条蠢件下不椅同温度乱下的氧柔气的最槐大消耗渐率或二面氧化碳缎的最大陷产出率箭，为以画后在不才同温度站下进行垫气调包找装提供撕数值参凡考。坡参考文天献泽[1]酱蚊罗纪盛伟、张丽躁萍、杨铁建雄量等矩.男生物化唐学简明样教鸣程矛[M]贫.乳北京：符高等教绍育出版芦社泊，舰200案0卧：掠159啊~17狱6稼[2]攀D.S冬.Le脏e,P受.C.饰Hag零ger会,J.库Lee迟,a勺nd验K.L纪.Ya拿m.M芦ode栋lf踩or愚Fre宴sh肉Pro友cuc勿eR职esp趋ira歪tio散ni冠nMo貌dif紫ied士At味mos若phe怪res泊Ba悬sed惊on岩Pri现nci面ple领so穿fE彩nzy拥me携Kin瞧eti膊cs[辱J].榆J.刃Foo羊dS胸ci.钟199标1村，具56(被6渔)威：趟158嫂0~1刑585取[3]断洋刘颖，茅李云飞由，王如失竹，田械平海，调杨宏道顺饲.刚基队于舰Mic衔hae斗lis拐-Me盗nte欢n归型呼吸音速率的福实验研典究础.击上海交兔通大学梯学报删，行200孝4皆，策3押8仗（狐7爱）压：地117焦0~1趣173租[4]汤Yo乓ons饭eok贺Son豪g,D出ong们Su具nL时ee蜜and跌Ki录tl.蒜Yam街.Pr窄edi旱cti损ng薪rel轨ati永ve尿hum承idi请ty馆in岗mod或ifi级eda坊tmo映sph结