生物物理学圆二色光谱

生物物理学圆二色光谱第一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日UVmChiral第二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日UVmPlane(linearly)polarizedlightChiral椭圆偏振光mOpticallyActiveSample第三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日m？第四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日4.1圆二色光谱的基本原理4.2圆二色光谱分析在生物学研究中的应用4.3圆二色光谱实验中的注意事项第五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日4.1圆二色光谱的基本原理4.2圆二色光谱分析在生物学研究中的应用4.3圆二色光谱实验中的注意事项第六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日WhatisaLight?

日月之辉第七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日第八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日16世纪,Newton,光谱光谱：复色光经色散系统分光后，按波长（或频率）的大小依次排列的图像上帝说要有光,于是有了牛顿。第九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日1916年,Einstein,激光1960-70,下村修,绿色荧光蛋白第十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日第十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日波长λ5×10-3～0.10.1～1010～200200～400名称γ射线x射线远紫外光近紫外光波长λ400～750750～1.0×1061.0×106～1.0×1091.0×109～1.0×1012名称可见光红外光微波无线电波电磁波谱：将电磁辐射按照波长或频率的大小顺序排列起来即称为电磁波谱第十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日1、自然光光具有波、粒二象性，是横电磁波。只有横波才有偏振现象:光矢量的振动方向与光的传播方向垂直，

在垂直于光传播方向的平面内,有不同的振动方向。电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、相位相同。v0HE第十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日第十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，晶片吸收振动面与晶轴垂直的光，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。2、光的偏振第十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日自然光平面偏振光起偏器检偏器晶轴相互平行时，透射光强度最大；晶轴相互垂直时，透射光强度为零；晶轴夹角为α时，透射光强度与cos2α成正比。.................第十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日也称线（完全）偏振光，简称偏振光。它的振动面称为其偏振面。振动方向保持不变振幅发生周期性变化E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段3、平面偏振光（Planepolarizedlight）第十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日振幅保持不变，而方向周期变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进4、圆偏振光（Circularpolarizedlight）第十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日朝光源看，电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光；电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。第十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日一束自然光可以看作是两束相互垂直而没有相位关系的平面偏振光的加和。平面偏振光可以分解成两束相位相等而旋转方向相反的圆偏振光的加和。两束相互垂直且相位相差1/4波长的平面偏振光可以加和成一束圆偏振光。当振幅相等，并同步的左、右圆偏振光相加，则产生平面偏振光；如果这两束圆偏振光的振幅不等则产生椭圆偏振光(ellipticallypolarizedlight)。5、光的叠加原理第二十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日XY频率相同

方向相反振幅相同

相位相同线偏振光参照面第二十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日频率相同

方向相反振幅相同相位不同线偏振光2参照面1第二十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差1/4波长的两平面偏振光合成圆偏振光右旋第二十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日yy’axx’RL椭圆偏振光频率相同

方向相反振幅不同

相位不同参照面21第二十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日旋转方向相反的左、右圆偏振光透过一光学活性物质后透过的左、右圆偏振光振幅相位矢量和相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光，方向改变不等相同椭圆偏振光不等不同椭圆偏振光，方向改变第二十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日旋光性：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光虽然仍然为平面偏振光，但其偏振面旋转了一定的角度。旋光物质又称为光学活性物质。旋光度：偏振面旋转的角度

旋光色散：不同波长的偏振光的旋转角度不同。旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。6、旋光色散（Opticalrotatorydispersion）第二十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日圆双折射：某个物质对于左、右圆偏振光的折射率分别为nL和nR，

若

nL=nR，则为光学各向同性物质；若

nL≠nR，则为光学各向异性物质；左、右圆偏振光的相位改变，若nL＞nR，透射光的偏振面右旋。若nL＜nR，透射光的偏振面左旋。旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nL≠nR的结果。第二十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日光的吸收若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收，则透射光的光强度小于入射光。7、光的吸收和圆二色性（Circulardichroism，CD）第二十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日椭圆偏振光OpticallyActiveSampleChiralPlane(linearly)polarizedlightRightandLefthandcircularlypolarizedlightPreferentialabsorptionoflefthandpolarized?第二十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日圆二色性的存在将通过该物质传播的左、右圆偏振光变成椭圆偏振光，并且只在发生吸收的波长处才能观察到。第三十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日圆二色性与椭圆率

A=lgI0/I=(1/2,303)lnI0/I=εCLBeer-LanmbertLaw

=2.303

A/4(弧度)ΔA=AL-

AR=Δε

C

LLOpticalactiveobjectEx=E0

cos[ωt-(2L/λ)n

+φ0]

?第三十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日C:

摩尔浓度L:

光程(dm)[]l:

[deg•mol-1•cm-1]

or

[deg•cm2•dmol-1]

摩尔椭圆率[],[]

l

themolarellipticity[]lMRw

=MRw

[y]l

/100比椭圆率[y]l

thespecificellipticity平均残基椭圆率[]lMRw

themeanresidue

ellipticity[]l=Mw

[y]l

/100[]

=

/CL第三十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日同时产生包括同样的分子结构信息：光学活性物质分子中的不对称生色团。CD反映光与分子间能量的交换，旋光性则是与分子中电子的运动有关。可以由Kronig-Krammers转换方程相互转换。8、ORD与CD光谱第三十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日CD谱的极值处与吸收峰一致（科顿效应，cottoneffect），因而分子中不同生色团对于谱的贡献比在ORD中更容易分辨。ORD是渐近线，两端不回归ORDCD吸收带附近，旋光度由负到正正Cotton效应正CD带吸收带附近，旋光度由正到负负Cotton效应负CD带第三十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日CD比ORD容易辨别重叠峰CD比ORD弱带易检测CD比ORD更容易拟合CD比ORD提供较多意义明确的信息表明有三个生色团，其中两个有光学活性第三十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器;M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器；9、J-810圆二色光谱仪第三十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日PeltierCellHolderCD/TotalFluorescenceFMOStoppedFlow-20～200℃第三十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日4.1圆二色光谱的基本原理4.2圆二色光谱分析在生物学研究中的应用4.3圆二色光谱实验中的注意事项第三十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive蛋白质的光学活性第三十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日1、氨基酸的圆二色性可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。2、肽的圆二色谱活性肽构象与其生理功能的关系肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。第四十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Far-UV(250-170nm)

SecondaryStructure:α-helix,β-sheet,β-turn,random

TertiaryStructureClass:all-α,α+β,α/β,all-βI,all-βIINear-UV(320-250nm)：aromaticsidechainNear-UV~Near-infrared(300-1000nm)：coloredproteins第四十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日苯丙氨酸（phenylalanine，

Phe）：255、261和268nm附近；酪氨酸（tyrosine，

Tyr）：277nm左右；色氨酸（tryptophan，

Trp）：279、284和291nm附近；二硫键的变化反映在整个近紫外区。芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区表现出CD信号第四十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日NearUVCDspectrum蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区250～320nm，表现出CD信号。Phe残基:255、261和268nm附近；Tyr残基:277nm左右；而在279、284和291nm是Trp残基的信息；二硫键的变化信息反映在整个近紫外CD谱上。近紫外CD谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境的扰动，能用来研究蛋白质三级结构精细变化。第四十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日FarUVCDspectraofpoly-L-Lys1、100%α-螺旋2、100%β-折叠3、100%无规卷曲第四十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日CDapplicationSecondarystructureofmacromoleculea-helixa-helix:19xnm(+)208nm,222nm(-)[q]xE-30200210220230240nmb-sheet:195nm(+)antiparallel:redshiftparallel:blueshift215-7nm(-)b-sheetUnorderedstructure:(-)below200nm(+)218nmweakbandunorderedb-turn:180-190nm(-)200-205nm(+)225nm(+)band,weakredshift第四十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures-band(nm)+band(nm)α-helix222208192β-sheet216195β-turn220-230(weak)180-190(strong)205polyproIIhelix190210-230weakRandomcoil200212第四十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日第四十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日3、估算蛋白质二级结构含量仅适合α-Helix含量较高的蛋白质！将测得的CD曲线与标准曲线拟合。xa+xb+xc=1.0qt=xaqa+xbqb+xcqc改变xa、xb和xc，使qt与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，leastsquaresminimization）未知结构的蛋白的CD信号第四十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日myoglobin

qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith

xa=80%

xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coilForfurtherdetails:/cd/cdtutorial.htm第四十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日GCN4-p1

0oC：100%helix 75oC：0%helixwhatabout50oC?

qt=xoqo+x75q75fitsbestwith

xo

=50%

x75=50%

Showsthatat50oC

1/2ofpeptidea-helixdimer 1/2ofpeptiderandomcoilmonomer第五十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日BestfittingproceduresusemanydifferentproteinsforstandardspectraTherearemanydifferentalgorithms.Allrelyonusingupto20CDspectraofproteinsofknownstructure.Bymixingthesetogetherafitspectraisobtainedforanunknown.Forfulldetailssee Dichroweb:theonlineCDanalysistool

www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cangenerallygetaccuraciesof

0.97forhelices, 0.75forbetasheet, 0.50forturns,and 0.89forotherstructuretypes(Manavalan&Johnson,1987,Anal.Biochem.167,76-85).第五十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日LimitationsofCDsecondarystructureanalysisThesimpledeconvolutionofaCDspectruminto4or5componentswhichdonotvaryfromoneproteintoanotherisagrossover-simplification.ThereferenceCDspectracorrespondingto100%helix,sheet,turnetcarenotdirectlyapplicabletoproteinswhichcontainshortsectionsofthevariousstructurese.g.TheCDofanα-helixisknowntoincreasewithincreasinghelixlength,CDofβ-sheetsareverysensitivetoenvironment&geometry.FarUVcurves(>275nm)cancontaincontributionsfromaromaticamino-acids,inpracticeCDismeasuredatwavelengthsbelowthis.TheshapesoffarUVCDcurvesdependontertiaryaswellassecondarystructure.第五十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日ApplicationsofCDinstructuralbiologyDeterminationofsecondarystructureofproteinsthatcannotbecrystallisedInvestigationoftheeffectofe.g.drugbindingonproteinsecondarystructureDynamicprocesses,teinfoldingStudiesoftheeffectsofenvironmentonproteinstructureSecondarystructureandsuper-secondarystructureofmembraneproteinsStudyofligand-inducedconformationalchangesCarbohydrateconformationInvestigationsofprotein-proteinandprotein-nucleicacidinteractionsFoldrecognition

第五十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日克山病探究-硒缺乏模型动物心肌线粒体膜的CD谱[]正常对照病区粮病区粮,补加蔬菜第五十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日烟草花叶病毒侵染膜蛋白第五十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Aβ40蛋白构象转变--------withcholesterolwithoutcholesterol第五十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Unfolding/folding216nm222nm第五十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Conformationalvaries190200210220230240250260-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.0

a5in5%SDS/PBSa5in50%TFE/PBSa5inpH7a5in50%TFE/H2Oa5inH2O[¦È]X1E-4deg.cm2/dmol-1wavelength(nm)216nm第五十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日

CDspectraofGCN4leucinezipperinthepresenceofdifferentconcentrationsofSDSLeucinezipperpeptidewastreatedwithSDSfor5min.ItsCDspectrawasthenmeasuredatafinalpeptideconcentrationof20μM.ThefinalSDSconcentrationswere0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6,1.0,1.2mMforcurves1,2,3,4,5,6,7,and8,respectively.Curve9isforthecompletelyunfoldedpeptidetreatedwith4Mguanidiniumchloride.Theexperimentswerecarriedoutat20oC.第五十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Conformationaltransition:

fromalpha-helixrichtobeta-sheetrichPrPc

PrPscScout第六十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日NearUVspectra:toinvestigatethetertiarystructure第六十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日

Lau,TanejaandHodges(1984)J.Biol.Chem.259:13253-13261螺旋二聚体分解为单螺旋三氟乙醇（trifluoroethanol，TFE）诱导肽链形成螺旋TFE对卷曲螺旋（coiled-coil）的影响第六十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日——chymotrypsin(allβ)——lysozyme(α+β)——triosephosphateisomerase(α/β)——myoglobin(allα)CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructure第六十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日pH变化引起的肌球素变性前后CD谱的动力学变化第六十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日稀释前后的荧光和CD谱从伸展到折叠α螺旋含量的变化的动力学检测KineticTraceat222nm(secondarystructureregion)Unfoldingstate(random)Refoldingstate(α-Helix)第六十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Kinetictracesat289nm(Aromaticsidechainregion)细胞色素c伸展和折叠状态的CD和荧光光谱反映了芳环侧链（色氨酸残基）的变化盐酸胍中的细胞色素c(伸展状态)与PBS混合后的CD和荧光光谱第六十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期日4.1圆二色光谱的基本原理4.2圆二色光谱分析在生物学研究中的应用4.3圆二色光谱实验中的注意事项第六十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期日SampleconcentrationAgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV-VISspectra.CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV-VIS:bestS/Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0.6to1.2.It’susuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance(ofsample+solvent)isover2O.D.第六十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期日样品杯：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆二色性。光程：0.01cm-1cm，为了降低溶剂影响，一般提高样品浓度，用短光程。cellpathlength第六十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期日NitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation第七十页，共八十一页，编辑于2023年，星期日HTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired.theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance.BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible.AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel.第七十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期日第七十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butcompatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned.AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted.IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection.Tradeinofaccuracyversussensitivity(i.e.theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired.2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrial第七十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期日标准操作时谱带宽度选为1nm；远UV区（2nm），芳香族氨基酸区（1nm）高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时PMT电压较高，信噪比差；当样品的光密度很高、CD很小时，就要保持测试CD峰多需要的足够浓度，并用较宽的狭缝宽度。此时，由于样品OD值过高，可能存在有荧光或杂散光引起的某些假象。第七十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期日Numberofdatapointdatapitch,i.e.numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel.Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithm第七十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期日AccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra.HeretootheS/Nwillimprovewiththesquareroo