塔格糖生物转化的研究进展演示文稿

塔格糖生物转化的研究进展演示文稿当前第1页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖生物转化的研究进展当前第2页\共有35页\编于星期四\16点Contents1.塔格糖的生理活性和功能2.塔格糖的应用现状3.塔格糖的专利情况4.生物法生产塔格糖的进展

5.个人总结当前第3页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖的生理活性和功能当前第4页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖的理化性质属性值化学家族碳水化合物，单糖，己酮糖，D-半乳糖的异构体分子式C6H12O6分子量180物理性状白色晶体气味无熔点134℃pH范围2.0-7.0溶解性

58%w/w（21℃）相对甜度为蔗糖的92%（10%溶液中）冷却效应无卡路里值1.5kcal/g美拉德反应和焦糖化反应是当前第5页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖的生理活性和功能1.提供低能量2.降低血糖3.具有肠道生物活性4.抗龋齿

当前第6页\共有35页\编于星期四\16点美国Spherix公司生产的塔格糖名称当前第7页\共有35页\编于星期四\16点当前第8页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖代谢途径高等动物由于不具塔格糖-6-磷酸途径，因此D-塔格糖不能被自然地代谢。当前第9页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖的应用现状2000年FDA已正式批准塔格糖作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；JECFA（联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会）第57次会议批准塔格糖作为食品添加剂，推荐ADI值0-80mg/kg；欧盟也于2003年批准塔格糖在欧洲上市；目前塔格糖在美国已被大量用于健康饮料以及酸奶、果汁等产品中作为白糖的代用品。塔格糖产品目前已获得美国、澳大利亚、日本、韩国等食品卫生部门批准使用，在我国仍未获得批准使用。当前第10页\共有35页\编于星期四\16点塔格糖的应用现状2006年8月百事可乐公司正式在雪碧饮料中使用塔格糖，作为风味的强化剂，这是塔格糖第一次进入商业领域。

2007年新西兰Miada运动营养食品公司将塔格糖应用于巧克力产品的开发，五月投放澳大利亚和新西兰超级市场。据BCC预测，新进入市场的塔格糖将会以一种稳定的速度增长，估计在今后五年内为20％～25％。

当前第11页\共有35页\编于星期四\16点关于塔格糖的专利情况

2000

ProcessformanufacturingD-tagatose

从干酪乳清、牛奶或其混合物中利用若干步骤（包括L-AI催化）产生D-塔格糖，涉及了许多常温菌属。2005ThermostableL-AIandprocessforpreparingD-tagatose

（韩国）

利用源自耐热菌属Thermotoganeapolitana的热稳定L-AI生产塔格糖，及其基因表达当前第12页\共有35页\编于星期四\16点关于塔格糖的专利情况2006Processformanufacturingoftagatose

（丹麦）

Bacillus,Sulfolobus,ThermoanaerobacterorThermotoga2006Thermostableisomeraseandusehereof,inparticularforproducingtagatose

（丹麦）

ThermoanaerobacterspeciessuchasThermoanaerobactermathranii当前第13页\共有35页\编于星期四\16点生物法生产塔格糖的最新进展生物法化学法化学污染物碱性条件副产物多分离困难当前第14页\共有35页\编于星期四\16点当前第15页\共有35页\编于星期四\16点Jung-WooKim等利用大肠杆菌克隆表达了耐热均Thermussp.IM6501的AI，该酶最适pH和温度分别为8.0和60℃，并且60U该酶在10mL0.1%半乳糖溶液中反应3天最终转化率达54%。当前第16页\共有35页\编于星期四\16点研究了耐热酶BHAI和GSAI对金属的依赖性及对金属与酶的构相及活性之间的关联。BHAI无金属依赖性，GSAI的活性受Mn2+的影响。推测金属在较高的温度下调节着该酶的活性三级结构。BHAIGSAI当前第17页\共有35页\编于星期四\16点首次研究了嗜酸耐热菌的AI,最适pH为6.0-6.5，并与源自耐热菌B.halodurance的AI（最适pH为7.5-8.0）进行比较研究，得到两种突变酶K269E和E268K，Lys-296对pH有重要作用。

当前第18页\共有35页\编于星期四\16点在大肠杆菌中表达了源自耐热菌Thermoanaerobactermathranii的AI，并研究了双酶及三酶偶联连续化反应器生产塔格糖及混合糖浆。25h后，塔格糖含量可达200mM当前第19页\共有35页\编于星期四\16点

G.thermodenitrificansL-AI经过单点和双点定点突变技术，获得2个突变点的酶（分别是N475K单点突变和C450S-N475K双点突变），经检测，这两种突变酶的酶活为原始酶的1.7和2.6倍。而且使塔格糖的转化率也分别提高12%和20%。当前第20页\共有35页\编于星期四\16点MoezRhimi等在大肠杆菌中表达了B.stearothermophilusUS100的AI,该酶无金属依赖性并且热稳定性高，最适pH和温度分别为7.5和80℃,3mg酶在含有5mM半乳糖的体系中在70℃时7h转化率达48%。(51U/mg)65℃75℃70℃当前第21页\共有35页\编于星期四\16点大肠杆菌L-AI单体含有498个氨基酸残基，其晶体结构如左图，由16个β折叠和17个α螺旋构成，可分为三个结构域：N-端结构域（1-176Aa）、中间结构域（177-327Aa）和C-端结构域（328-498Aa）。

大肠杆菌L-AI晶体结构带状图当前第22页\共有35页\编于星期四\16点大肠杆菌L-AI发挥酶的活性需要在三聚体下才能发挥，分别记号为A、B、C。三聚体的外表面显示出三个等价的裂口，裂口的组成为一个亚基的C-端结构域和中间结构域与另一个亚基的N-端结构域构成沿着裂口的氨基酸残基在嗜温、嗜热和高度嗜热的L-AI中都非常保守，这些残基大多位于一个环区域，表明其可能为调节结构以调节活性位点中底物进入和产物释放时的立体结构。

当前第23页\共有35页\编于星期四\16点大肠杆菌L-AI的裂口氨基酸组成与空间结构推测的酶结合与催化中心当前第24页\共有35页\编于星期四\16点A.Glu306的Oε2亲核进攻D-半乳糖C-2的氢原子使其去质子化，形成碳碳双键，碳氧双键断裂，形成氧负离子，氧负离子结合质子，最终形成ene-diol（烯二醇）中间体；B.Glu333的Oε2亲核进攻D-半乳糖C-2的羟基氢，生成C-2位置的碳氧双键，C-1与C-2之间的碳碳双键断裂，生成碳负离子，结合质子，最终生成D-塔格糖。推测的酶反应机理—烯二醇中间体反应机理ABCH当前第25页\共有35页\编于星期四\16点固定化表达源自耐热菌ThermotoganeapolitanaAI的大肠杆菌细胞以进一步提高热稳定性生产塔格糖。最适温度由85提高到90℃，70℃时的半衰期由0.8h提高到1.3h。2.5U酶量，在12mL0.5M半乳糖体系中20h转化率超过50%。当前第26页\共有35页\编于星期四\16点MoezRhimi等首次在大肠杆菌中共表达分别源自BacillusstearothermophilusUS100和StreptomycesSK的L-arabinoseisomerase和d-glucoseIsomerase，并固定化该细胞以同时生产塔格糖和果糖，两酶的最佳pH都为7.5，最适反应温度分别为80和85℃。经过8次重复利用后，该细胞中两种酶活仍保持70%以上，单批转化率为果糖10%，塔格糖20%。当前第27页\共有35页\编于星期四\16点DeokKunOh等人筛选出了两个对源自G.stearothermophilusAI的pH有影响的突变点并对其进行突变，突变酶Q408V和R408V的最佳pH值都从8.5改为7.5，最适条件下酶活分别提高60%和30%。GSAIR408VQ408V当前第28页\共有35页\编于星期四\16点来源最适温度（℃）最适pH半衰期（min）B.stearothermophilusUS100807.5-8.0110（75℃）Thermussp.608.5G.stearothermophilusT6707.0-7.552(80°C)Thermotogamaritima907-7.5185(90°C)Thermotoganeapolitana857.0120(90°C)Bacillushalodurans507.5-8.020(70°C)Alicyclobacillusacidocaldarius

656.0-6.5当前第29页\共有35页\编于星期四\16点国外主要研究热点目前关于L-AI的研究主要集中在嗜热菌，热稳定性酶有利于工业化生产。利用分子生物学手段对嗜热菌L-AI进行大量表达，提高产酶率。对嗜热菌L-AI进行分子水平的改造，如改变pH和酶活的突变等，以适合塔格糖的工业化生产。当前第30页\共有35页\编于星期四\16点本实验室研究情况筛选得到一株产L-AI的植物乳杆菌。建立了体系，并对产酶体系进行了优化。对该酶进行了分离纯化，并研究了其性质。最适温度和pH值分别为60℃和7.0。存在的问题酶活不高。0.049U/mL酶热稳定性不高，在60℃时半小时失活50%。当前第31页\共有35页\编于星期四\16点菌种酶活(U/mL发酵液）比酶活(U/mg蛋白质)转化率反应温度(℃)最适温度(℃)pH出处RecombinantE.coli(Thermus.spIM6501)4.60.19(纯酶)54%底物1g/L酶量40U反应时间72h60658.0BiotechnologyLetters2003MutantsofGeobacillusthermodenitrificans0.42(单点)0.57(双点)(纯酶)55%和58%底物1.8g/L反应时间6.7h65658.5BiotechnologyLetters2006RecombinantE.coli(Thermoanaerobactermathranii)

厌氧4.0(纯酶)25%底物300g/L时间48h65657.0ApplMicrobiolBiotechnol2004RecombinantE.coli(Thermotoganeapolitana)15.56(以阿拉伯糖为底物)120(以阿拉伯糖为底物)68%底物1.8g/L时间20h80857.0FEMSMicrobiologyLetters2002RecombinantE.coli(BacillusstearothermophilusUS100)185(纯酶)48%底物0.9g/L酶量555U(3mg)时间7h70807.5BiochimicaetBiophysicaActa2006LactobacillusplantarumSK-2厌氧菌0.0491.4(纯酶)39%底物100g/L酶量120U时间96h35607.0WorldJMicrobiolBiotechnol2006当