绪论酶分离纯化

绪论酶分离纯化演示文稿当前第1页\共有56页\编于星期四\7点（优选）绪论酶分离纯化当前第2页\共有56页\编于星期四\7点酶的提取与分离纯化将酶从细胞或发酵液中取出，再与杂质分开，获得所需的酶产品。酶的分离纯化工作,是酶学研究的基础.酶的纯化过程就目前而言,还是门实验科学.当前第3页\共有56页\编于星期四\7点酶的纯化过程与一般蛋白纯化过程相比有本身独有的特点:一是特定的一种酶在细胞中含量很少;二是酶可通过测定活力的方法加以跟踪.1、建立一个可靠和快速的测活方法；2、酶原料的选择；3、酶的提取；4、酶的提纯；5、酶的纯度检验。酶分离纯化的一般原则:当前第4页\共有56页\编于星期四\7点一细胞破碎（link)二酶的提取(link)三离心分离(link)四过滤与膜分离(link)

五沉淀分离(link)六层析分离七电泳分离八萃取分离九酶的结晶十浓缩与干燥主要内容go当前第5页\共有56页\编于星期四\7点一细胞破碎大多数酶存在于细胞内，需破碎后才能提纯细胞不同，结构不同，所用的破碎方法和条件有所不同细胞的破碎方法：（一）机械破碎法link（二）物理破碎法link（三）化学破碎法link（四）酶学破碎法link

back当前第6页\共有56页\编于星期四\7点原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞1机械捣碎法：捣碎机，10000rpm，实验、生产规模均可2研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械，效率较低3匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。Back（一）机械破碎法当前第7页\共有56页\编于星期四\7点包括:1、温度差破碎法;2、压力差破碎法;3、超声波破碎法;（二）物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎当前第8页\共有56页\编于星期四\7点1、温度差破碎法冷冻高温，用于脆弱易破菌，难以工业化;于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。

或:将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

当前第9页\共有56页\编于星期四\7点2、压力差破碎法高压冲击法用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英沙等混合物。突然降压法加压至30MP以上，打开出口阀突然降为常压爆破性减压法用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。渗透压差法利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋微生物中提取某些酶。当前第10页\共有56页\编于星期四\7点频率10~20KHz，功率100~150W，温度0~10oC，pH4~7，时间3~10min，间隔多次;对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz声波或10～500kHz超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便.且效果也好，但一次处理量较小;应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在;处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。3、超声波破碎法在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。破坏程度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大。操作条件Back当前第11页\共有56页\编于星期四\7点（三）化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏。有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。

1、有机溶液处理粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。操作当前第12页\共有56页\编于星期四\7点表面活性剂和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。常用的非离子型表面活性剂为：Triton和Tween。用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。2、表面活性剂处理Back当前第13页\共有56页\编于星期四\7点（四）酶学破碎法在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。简单原理:用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1、外加酶处理当前第14页\共有56页\编于星期四\7点1g菌体加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，溶菌酶能专一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键。革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。酵母：其细胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖酶；霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用几丁质酶；植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。当前第15页\共有56页\编于星期四\7点将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。适宜的自溶条件：温度、pH值、离子强度等加入噬菌体感染细胞电离辐谢2、自溶法Back当前第16页\共有56页\编于星期四\7点二酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称酶的抽提。大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。

当前第17页\共有56页\编于星期四\7点盐溶现象:在一定浓度的盐存在下,酶的溶解度增加.盐析现象:当盐的浓度太高,蛋白的浓度反而下降,从溶液中析出.一般采用稀盐溶液，0.02~0.05mol/L。

等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。酶提取的主要方法1、盐溶液提取当前第18页\共有56页\编于星期四\7点有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用焦磷酸钠缓冲液等。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及pH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。当前第19页\共有56页\编于星期四\7点蛋白质提取液的pH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。

2、酸溶液提取、碱溶液提取原则：当前第20页\共有56页\编于星期四\7点如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取；肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取；某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择pH3～6范围对于分离提取是有利的。当前第21页\共有56页\编于星期四\7点与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机溶剂提取。有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。例:从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。3、有机溶剂提取当前第22页\共有56页\编于星期四\7点丁醇提取法的pH及温度选择范围较广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。用之提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。当前第23页\共有56页\编于星期四\7点影响酶提取的主要因素1、温度为了防止酶变性失活，温度不宜高；多数酶的提取温度在5℃以下；耐温较高的酶可适当提高温度，以提高酶溶解度和扩散速率。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。当前第24页\共有56页\编于星期四\7点2、pH值为了防止酶的变性，pH不宜过高或过低；溶液的pH值应远离酶的等电点，以增加酶的溶解度。3、提取液的体积提取液的用量增加，可提高提取率；过量，酶浓度降低，不利进一步纯化。back当前第25页\共有56页\编于星期四\7点三离心分离离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、密度的物质分离的技术；要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。当前第26页\共有56页\编于星期四\7点1、常速离心机最大转速8000rpm。2、高速（冷冻）离心机1×104-2.5×104rpm3、超速离心机转速：2.5-8×104rpm，分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；离心机的种类与用途当前第27页\共有56页\编于星期四\7点台式高、超速离心机0.6-10万转/分以上离心机制备性分析性分析性超速离心机普通离心机冰冻离心机台式（或地面式）普通离心机大容量冰冻离心机小于0.6万转/分高速冰冻离心机0.6-2.5万超速冰冻离心机2.5-8万或更高(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等)概述当前第28页\共有56页\编于星期四\7点当前第29页\共有56页\编于星期四\7点当前第30页\共有56页\编于星期四\7点当前第31页\共有56页\编于星期四\7点当前第32页\共有56页\编于星期四\7点对常速、高速离心,由于所分离的颗粒大小和密度相差较大,较易达到效果,应用以上离心设备;若从样品液中分离2种以上大不密度不同的颗粒,则应用以下包括差速离心在内的制备性超离心技术;离心方法的选用当前第33页\共有56页\编于星期四\7点一般为4oC。稳定性好的酶，可取室温；超高速离心需冷冻。pH值应处于酶稳定的pH范围。温度和pH值back当前第34页\共有56页\编于星期四\7点四过滤与膜分离过滤

借助过滤介质将大小不同，形状不同的物质分离的技术介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等。以膜为过滤介质的过滤称膜分离技术；微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属于膜分离技术当前第35页\共有56页\编于星期四\7点表1-2过滤的分类与特性（P16）类别

截留的颗粒大小主要物质过滤介质粗滤>2um酵母、霉菌、动植物细胞、固形物滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷微滤0.2~2um细菌、灰尘微滤膜超滤20A~0.2um病毒、生物大分子超滤膜反渗透<20A生物小分子、盐、离子反渗透膜当前第36页\共有56页\编于星期四\7点表例：当前第37页\共有56页\编于星期四\7点一、非膜过滤截留颗粒直径大于2μm,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣等。过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等。(1)常压过滤以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。(2)加压过滤以压力泵或压缩空气为推动力。效果较好，生产上应用广泛。(3)减压过滤真空过滤、抽滤。多用于粘性不大的物料。1、粗滤2、微滤微孔过滤,截留颗粒直径0.2～2μm，光学显微镜可见颗粒，采用微孔陶瓷、微滤膜等。当前第38页\共有56页\编于星期四\7点二、膜分离技术借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术。薄膜有丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。当前第39页\共有56页\编于星期四\7点

膜过程国家年代应用

微滤*德国1920年实验室用（细菌过滤器）

超滤*德国1930年实验室用

血液透析*荷兰1950年人工肾

电渗析#美国1955年脱盐

反渗透#美国1960年海水脱盐

超滤#美国1960年大分子物质浓缩

气体分离#美国1979年氢回收

膜蒸馏*德国1981年水溶液浓缩

全蒸发#德国/荷兰1982年有机溶液脱水膜分离技术发展阶段*:小规模；#：工业规模当前第40页\共有56页\编于星期四\7点以薄膜两边的流体静压差为推动力；根据截留的颗粒大小可分为3种；MEF微滤器根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同分三类。（1）微滤截留的物质颗粒直径为0.2～2um，操作压力0.1MPa以下。1、加压膜分离当前第41页\共有56页\编于星期四\7点(2)超滤截留的物质颗粒直径为20～2000Å（0.2um）；可同时截留菌丝体和可溶性蛋白。

操作压力50～700KPa；特别适于液体酶制剂的生产；对需要辅酶的酶的生产不适用；SHM系列膜分离装置【截留分子量】：300～50000道尔顿；

【操作压力】：0.1～0。2Mpa

【操作温度】：20～50℃。在发酵行业中，由于传统分离工艺技术条件的限制，预处理中常有5-15%的产品损失，大量的可溶性蛋白、大分子杂质被带入到下游工序，增加了后提取工艺的环节和负荷，影响产品质量及生产收率。Ultra-flo超滤分离技术彻底突破这一技术瓶颈。当前第42页\共有56页\编于星期四\7点超滤(续)超乎寻常的膜通量，且维持恒定适合处理高粘度、高含固量料液浓缩倍数极高，可使浓缩液呈糊状消除浓差极化，不易堵塞，易清洗系统可逐级拓展，中试结果完全适用于生产规模当前第43页\共有56页\编于星期四\7点(3)反渗透反渗透（RO）是膜分离技术的一个重要组成部分

膜孔径小于20Å，操作压力为0.7～13MPa。用于海水淡化。在水过滤时利用反渗透膜的选择性透过原理，通过设备的高压泵对经过反渗透膜的原水施加一定压力，在压力作用下原水中的水分子可以透过膜而渗析出来，而其他无机盐、微生物与有机物等却由于反渗透膜对这些物质的截留特性而不能透过膜，从而可以获得纯净的无离子水。

当前第44页\共有56页\编于星期四\7点（2）离子交换膜电渗析2、电场膜分离在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移动，透过半透膜，达到分离目的。（1）电渗析样品液缓冲液如图离子交换膜代替一般膜当前第45页\共有56页\编于星期四\7点主要指透析；利用小分子扩散作用透过半透膜，而大分子被截留；用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。透析设备简单，但操作时间长，要更换水或缓冲液。3、扩散膜（透析）膜分离膜公司网站Back当前第46页\共有56页\编于星期四\7点五沉淀分离改变某些条件，使溶液中某种溶质溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离。是酶分离纯化常用的方法之一。其本质是降低溶液的溶解度。方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀等,表4-3.当前第47页\共有56页\编于星期四\7点在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶因溶解度各不相同而分离。盐为什么会改变蛋白酶的溶解度？盐在溶液中离解为正负离子，反离子作用改变蛋白酶分子表面的电荷；同时离子存在改变水活度使分子表面水化膜改变。1、盐析沉淀法『盐溶』是加盐使蛋白质融入水中，『盐析』是加盐使蛋白质沉淀出來。两者所加的盐类不同，其作用机制也毫无关系。当前第48页\共有56页\编于星期四\7