红外分光光度法测定操作规程

红外分光光度法测定操作规程目的：为了规范红外分光光度法测定操作，保证检验结果的准确性，制定本规程。范围：适用于物质的定性鉴别、物相分析和定量测定，并用于研究分子间和分子内部结构的相互作用。依据：《中国药典》2020年版四部40页0402“红外分光光度法”《中国药典》2020年版四部375页4002“包装材料红外光谱测定法”《包装材料红外光谱测定法》YBB00262004-2015《中国药典分析检测技术指南》《药品红外图谱集》责任：检验员对本规程的实施负责内容：简述：红外分光光度法是在4000〜400cm-i波数范围内测定物质的吸收光谱，用于化合物的鉴别、检查或含量测定的方法。除部分光学异构体及长链烷烃同系物外，几乎没有两个化合物具有相同的红外光谱，据此可以对化合物进行定性和结构分析；化合物对红外辐射的吸收程度与其浓度的关系符合朗伯-比尔定律，是红外分光光度法定量分析的依据。仪器及其校正：可使用傅里叶变换红外光谱仪或色散型红外分光光度计。用聚苯乙烯薄膜（厚度约为0.04mm）校正仪器,绘制其光谱图，用3027cm-i,2851cm-i，1601cm-i，1028cm-i，907cm-i1处的吸收峰对仪器的波数进行校正。傅里叶变换红外光谱仪在3000cm-i1附近的波数误差应不大于土5cm-i，在1000cm-i附近的波数误差应不大于土lcm-i。用聚苯乙烯薄膜校正时，仪器的分辨率要求在31102850cm-i范围内应能清晰地分辨出7个峰，峰2851cm-i与谷2870cm-1之间的分辨深度不小于18%透光率，峰1583cm-1与谷1589cm-1之间的分辨深度不小于12%透光率。仪器的标称分辨率，除另有规定外，应不低于2cm-i。供试品的制备及测定：通常采用压片法、糊法、膜法、溶液法和气体吸收法等进行测定。对于吸收特别强烈或不透明表面上的覆盖物等供试品，可采用如衰减全反射、漫反射和发射等红外光谱方法。对于极微量或需微区分析的供试品，可采用显微红外光谱方法测定。3.1原料药鉴别：除另有规定外，应按照国家药典委员会编订的《药品红外光谱集》各卷收载的各光谱图所规定的方法制备样品。具体操作技术参见《药品红外光谱集》的说明。采用固体制样技术时，最常碰到的问题是多晶现象，固体样品的晶型不同，其红外光谱往往也会产生差异。当供试品的实测光谱与《药品红外光谱集》所收载的标准光谱不一致时，在排除各种可能影响光谱的外在或人为因素后，应按该药品光谱图中备注的方法或各品种项下规定的方法进行预处理，再绘制光谱，比对。如未规定该品种供药用的晶型或预处理方法，则可使用对照品，并采用适当的溶剂对供试品和对照品在相同的条件下同时进行重结晶，然后依法绘制光谱，比对。如已规定特定的药用晶型，则应采用相应晶型的对照品依法比对。当采用固体制样技术不能满足鉴别需要时，可改用溶液法绘制光谱后与对照品在相同条件下绘制的光谱进行比对。3.2制剂鉴别：品种鉴别项下应明确规定制剂的前处理方法，通常采用溶剂提取法。提取时应选择适宜的溶剂，以尽可能减少辅料的干扰，避免导致可能的晶型转变。提取的样品再经适当干燥后依法进行红外光谱鉴别。3.3多组分原料药鉴别不能采用全光谱比对，可借鉴4.【附注】“4.2.（3）”的方法，选择主要成分的若干个特征谱带，用于组成相对稳定的多组分原料药的鉴别。3.4晶型、异构体限度检查或含量测定供试品制备和具体测定方法均按各品种项下有关规定操作。【附注】4.1各品种项下规定“应与对照的图谱（光谱集XX图）一致”，系指《药品红外光谱集》各卷所载的图谱。同一化合物的图谱若在不同卷上均有收载时，则以后卷所载的图谱为准。4.2药物制剂经提取处理并依法绘制光谱，比对时应注意以下四种情况：1） 辅料无干扰，待测成分的晶型不变化，此时可直接与原料药的标准光谱进行比对；2） 辅料无干扰，但待测成分的晶型有变化，此种情况可用对照品经同法处理后的光谱比对；3） 待测成分的晶型无变化，而辅料存在不同程度的干扰，此时可参照原料药的标准光谱，在指纹区内选择35个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的依据。鉴别时，实测谱带的波数误差应小于规定值的土5cm一1（0.5%）；4）待测成分的晶型有变化，辅料也存在干扰，此种情况一般不宜采用红外光谱鉴别。4.3由于各种型号的仪器性能不同，供试品制备时研磨程度的差异或吸水程度不同等原因，均会影响光谱的形状。因此，进行光谱比对时，应考虑各种因素可能造成的影响。《药品红外光谱集》说明5.1《药品红外光谱集》每卷有三个部分，即说明，光谱图和索引。光谱图系由《中华人民共和国药典》、国家药品标准中所收载的药品，用红外光谱仪录制而得。每幅光谱图并记载该药品的中文名、英文名、结构式、分子式、光谱号及试样的制备方法等。5.2试样的制备：5.2.1压片法：取供试品约1mg，置玛瑙研钵中，加入干燥好的漠化钾或氯化钾细粉约200mg，充分研磨混匀，移置于直径为13mm的压模中，使铺布均匀，抽真空约2分钟后，加压至0.8〜1GPa左右，保持2〜5分钟，除去真空，取出制成的供试片，目视检查应均匀透明，无明显的颗粒（也可采用其他直径的压模制片，样品与分散剂的用量可相应调整以制得浓度合适的片子）。将供试片置于仪器的样品光路中，并扣除用同法制成的空白漠化钾或氯化钾片的背景，录制光谱图。对漠化钾或氯化钾片的质量要求：用漠化钾或氯化钾制成的空白片，录制光谱图，基线应大于75%透光率；除在3440cm-1及1630cm-1附近因残留或附着水而呈现一定的吸收峰外，其他区域不应出现大于基线3%透光率的吸收谱带。5.2.2糊法：取供试品约5mg，置玛瑙研钵中，滴加少量液状石蜡或其他适宜的液体，制成均匀的糊状物，取适量夹于两个漠化钾片（每片重约150mg）之间，作为供试片；以漠化钾约300mg制成空白片作为背景补偿，录制光谱图。亦可用其他适宜的盐片夹持糊状物。5.2.3膜法参照5.2.2糊法所述的方法，将液体供试品铺展于漠化钾片或其他适宜的盐片中录制；或将供试品置于适宜的液体池内录制光谱图。若供试品为高分子聚合物，可先制成适宜厚度的薄膜，然后置样品光路中测定。5.2.4溶液法：将供试品溶于适宜的溶剂中，制成1%〜10%浓度的溶液中，置于0.1〜0.5mm厚度的液体池中录制光谱图，并以相同厚度装有同一溶剂的液体池作为背景补偿。5.2.5衰减全反射法将供试品均匀地铺展在衰减全反射棱镜的底面上，使紧密接触，依法录制反射光谱图。采用光路长度约为10cm的气体池，首先将气体池抽真空，然后充以适当压力（例如30〜50mmHg）的供试气体，录制光谱图。5.3制图：《药品红外光谱集》中光谱图的横坐标为波数（CM-1），纵坐标为透光率（T%）.收载的光谱图，系用分辨率为2CM-1条件绘制，基线一般控制在90%透光率以上，供试品取量一般控制在使其最强吸收峰在10%透光率一下。5.4光谱图的使用：5.4.1凡《中华人民共和国药典》，国家药品标准已收载红外光谱法作为原料药，《药品红外光谱集》中收载的相应光谱图供比对用。5.4.2《药品红外光谱集》收载光谱图的波数范围为4000〜400CM-1，但有的红外光谱仪的光谱录制范围不同，用此类仪器录制的光谱图，除另有规定外，亦可使用本光谱集所收载的光谱图中相应的波数区间比对。所用仪器的性能应符合《中华人民共和国药典》通则0402“红外分光光度法”项下要求。5.4.3固体药品在测定时，可能由于晶形的影响，致使录制的光谱图与《药品红外光谱集》收载光谱图不一致，遇此情况，应按《药品红外光谱集》中各相应光谱图中备注的方法或该品种中文中规定的方法进行预处理后，再行录制。5.4.4采用压片法时，影响图谱形状的因素较多，使用《药品红外光谱集》对照时，应注意供试片的制备条件对图谱形状及各谱带的相对吸收强度可能产生的影响。压片时，若样品（盐酸盐）与漠化钾之间不发生离子交换反应，则采用漠化钾作为制片基质。否则，盐酸盐样品制片时必须使用氯化钾基质。5.4.5常用的傅立叶变换红外光谱仪系单光束型仪器。因此，应注意二氧化碳和水汽等的大气干扰，必要时，应采取适当措施（如采用干燥氮气吹扫）予以改善。5.4.6为便于光谱的对比，《药品红外光谱集》收载了聚苯乙烯薄膜的光谱图。在比对所测药品的光谱图与本光谱集所收载的药品的光谱图时，宜首先在测定药品所用的仪器上录制聚苯乙烯薄膜的光谱图，与本光谱集收载的聚苯乙烯薄膜的光谱图加以比较，由于仪器间的分辨率存在差异及不同操作条件的影响，聚苯乙烯薄膜光谱图的比较，将有助药品光谱图比对时的判断。5.4.7由于谱图的质量或供试品的多晶型等原因，有些化合物的光谱图作了重新绘制，并收入后续卷中。若同一化合物的光谱图在不同卷中均有收载，用于鉴别时以后卷光谱图作为比对依据，前卷光谱图仅作为参考。包装材料的红外光谱测定技术：包括检测方法和制样技术。（依据《包装材料红外光谱测定法》YBB00262004-2015与《中国药典》2020年版四部375页4002“包装材料红外光谱测定法”）常用检测方法有透射法、衰减全反射（ATR）法和显微红外法等。6.1透射法：透射法是通过采集透过供试品前后的红外吸收光强度变化，得到红外吸收光谱。透射法光谱采集范围一般为4000〜400cm-i波数。根据供试品的制备方法不同，又分为热敷法、膜法、热裂解法等。6.1.1热敷法：本法适用于塑料产品及粒料。除另有规定外，将漠化钾片或其他适宜盐片加热后，趁热将供试品轻擦于热漠化钾片或其他适宜盐片上，以不冒烟为宜，录制光谱图。6.1.2薄膜法：本法适用于塑料产品及粒料。除另有规定外，取供试品适量，制成厚度适宜均一的薄膜。常用的薄膜制备方式可采用热压成膜，或者加适宜溶剂高温回流使供试品溶解，趁热将回流液涂在漠化钾片或其他适宜盐片上，加热挥去溶剂等方式。6.1.3热裂解法：本法适用于橡胶产品。除另有规定外，取供试品切成小块，用适宜溶剂抽提后烘干，再取适量置于玻璃试管底部，置酒精灯上加热，当裂解产物冷凝在玻璃试管冷端时，用毛细管取裂解物涂在漠化钾片或其他适宜盐片上，立刻采集光谱。经上述方法制备的供试品，均可采用透射法采集红外吸收光谱。6.2衰减全反射法（ATR法）：衰减全反射法是红外光以一定的入射角度照射供试品表面，经过多次反射得到的供试品的反射红外吸收光谱，该法又分为单点衰减全反射法和平面衰减全反射法。衰减全反射法光谱采集范围一般为4000〜650cm-1波数。本法适用于塑料产品及粒料、橡胶产品。除另有规定外，取表面清洁平整的供试品适量，与衰减全反射棱镜底面紧密接触，采用衰减全反射法采集光谱。6.3显微红外法：本法适用于多层膜、袋、硬片等产品。除另有规定外，用切片器将供试品切成厚度小于5um的薄片，置于显微红外仪上观察供试品横截面，选择每层材料，通常以透射法采集光谱。按上述方法采集的供试品红外吸收光谱，照品种项下规定要求进行判定。结果判断：采用红外光谱法对药品进行定性鉴别时，主要着眼于供试品光谱图与对照光谱图全谱的比较。即首先是谱带（即吸收峰）的数目（即峰数）是否一致，其次是谱带的位置（即峰位）是否一致，然后是各谱带的相对强弱（即峰强）是否一致，最后是谱带的形状（即峰形）是否一致。如供试品光谱图的峰数，峰位，峰强和峰形与对照图谱一致，则认为供试品光谱图与对照图谱一致，通常可判定两化合物为同一物质（只有少数例外，如有些光学异构体或大分子同系物等）。如两光谱图不同，则可判定两化合物不同。但下此结论时，需考虑供试品是否存在多晶型现象，纯度如何，仪器的性能如何，以及有无其他外界因素的干扰。一般情况下，二氧化碳、水蒸气、有机溶剂蒸气及样品的纯度和仪器的分辨率等因素均会影响吸收峰的峰数；仪器的分辨率和波数精度等会影响吸收峰的峰位;样品和漠化钾/氯化钾的研磨程度、片子的均匀性、样品在片子中的浓度及环境湿度等因素会影响吸收峰的峰强或峰形。进行光谱比对时，应综合考虑上述各种因素可能造成的影响。此外，采用固体样品制备法，如遇多晶现象造成的实测光谱图与对照光谱图有差异时，一般可按照《药品红外光谱集》中所载重结晶处理法或与对照品平行处理后测定。但如对药用晶型有规定时，则不能自行重结晶。光谱解析应按照由简单到复杂的顺序。习惯上多采用两区域法：将光谱划分为特征区及指纹区两个区域进行解析。现将每个区域在光谱解析中主要解决哪些问题，分述如下。7.1特征区的判断（4000〜1250cm-i）：确定化合物的类别：是芳香族、脂肪族饱和或不饱和化合物。主要由碳氢振动的类型及是否存在芳环的骨架振动来判别。7.2指纹区（1250〜200cm-i）7.2.1指纹区的许多吸收蜂与特征区吸收蜂相关，可作为化合物含有某一基团的旁证。7.2.2由指纹区提供的信息，可以确定化合物的较细微结构。如芳环上的取代位置、判别几何异构体等。苯环上取代基的位置，可由苯环上的芳氢面外弯曲振动判定，此峰强度大，易辨认。7.3解析方法：四先、四后、相关法：遵循先特征（区）、后指纹（区）；先最强（峰）、后次强（峰）；先粗查、后细查；先否定、后肯定的顺序及由一组相关峰确定一个官能团存在的原则。即四先、四后、相关法。7.3.1先识别特征区第一强峰的起源（由何种振动引起），及可能归属（属于什么基团）。先按待查吸收峰的峰位，查找光谱上九个重要区域表，初步了解吸收峰的起源。再返回未知物光谱，查对这些相关峰或主要相关峰是否存在，则第一强峰的归属可以初步认定，这一步可称为“粗查”。光谱解析先从特征区第一强峰入手，是因为特征区峰疏，易辨认。7.3.2第一强峰的归属确认后，再依次解析特征区第二、第三强峰，方法同上。吸收峰的不存在对否定管能团的存在比吸收峰的存在而肯定管能团的存在更有确凿力。测量操作注意事项：8.1环境条件：红外光谱仪实验室的温度应控制在15〜30°C，相对湿度应小于65%,适当的通气换风，以免积聚过量的二氧化碳和有机溶剂蒸汽。8.2除另有规定外，样品应在制样前，按照药品质量标准中各品种项下干燥失重的条件进行干燥，若药品为不检查干燥失重、熔点范围低限在135C以上、受热不分解的供试品，可采用105C进行干燥；熔点在135C以下或受热分解的供试品，可在五氧化二磷干燥器中干燥过夜或采用其他适宜的干燥方法进行干燥，如恒温减压干燥。若样品未收载在药品质量标准中，可参考相关文献或根据其熔点情况选择适当的干燥条件对其进行干燥。8.3背景补偿或空白校正：记录供试品光谱时，双光束仪器的参比光路中因置相应的空白对照物：单光束仪器应先进行空白背景扫描，扫描供试品后扣除背景吸收，即得供试品光谱。8.4采用压片法制样时以漠化钾最常用。若供试品为盐酸盐，看比