昆医分生蛋白质分子建模与设计演示文稿

昆医分生蛋白质分子建模与设计演示文稿当前第1页\共有85页\编于星期三\6点（优选）昆医分生蛋白质分子建模与设计当前第2页\共有85页\编于星期三\6点ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteins当前第3页\共有85页\编于星期三\6点UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunction当前第4页\共有85页\编于星期三\6点引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用;……从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量专一性很强不产生副作用并且能很快降解当前第5页\共有85页\编于星期三\6点蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:(1)蛋白质分子量非常大(10000-1000000)，不能通过化学方法生产;(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;(3)专一性致使其应用范围受到影响。

蛋白质应用受限的原因当前第6页\共有85页\编于星期三\6点蛋白质设计目前存在的问题1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性2、三级结构的确定性较差当前第7页\共有85页\编于星期三\6点计算机模拟突变蛋白质产品功能分析基因构建Pr设计循环第一节蛋白质分子设计原理当前第8页\共有85页\编于星期三\6点蛋白质分子设计的流程天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质三维结构结构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征新蛋白质数据的输入当前第9页\共有85页\编于星期三\6点Pr突变体设计的3个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质当前第10页\共有85页\编于星期三\6点在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合

当前第11页\共有85页\编于星期三\6点在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合

当前第12页\共有85页\编于星期三\6点

蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠当前第13页\共有85页\编于星期三\6点所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力

蛋白质分子设计原理当前第14页\共有85页\编于星期三\6点金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。

蛋白质分子设计原理当前第15页\共有85页\编于星期三\6点最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题

蛋白质分子设计原理当前第16页\共有85页\编于星期三\6点一、蛋白质分子设计的分类设计的目的主要有两个：

一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；

当前第17页\共有85页\编于星期三\6点二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。

当前第18页\共有85页\编于星期三\6点（一）蛋白质分子设计的层次分为两个层次：

一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计；二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。当前第19页\共有85页\编于星期三\6点（二）蛋白质分子设计的分类1．定点突变或化学修饰法2．拼接组装设计法3．从头设计全新蛋白质当前第20页\共有85页\编于星期三\6点二、蛋白质分子设计的原则1．活性设计2．对专一性的设计3．Scaffold设计(框架)4．疏水基团与亲水基团需合理分布5．最优的氨基酸侧链几何排列当前第21页\共有85页\编于星期三\6点溶菌酶结构例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。

Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3’端。当前第22页\共有85页\编于星期三\6点设计步骤蛋白质分子设计步骤图修正设计获得目标蛋白质序列合成检测结构信息分析建立结构模型设计目标蛋白质数据库当前第23页\共有85页\编于星期三\6点序列设计设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。

当前第24页\共有85页\编于星期三\6点第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。

当前第25页\共有85页\编于星期三\6点一、定位突变

基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。当前第26页\共有85页\编于星期三\6点（一）定位突变的设计目标及解决方法

定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。

当前第27页\共有85页\编于星期三\6点Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度

当前第28页\共有85页\编于星期三\6点（二）定位突变的种类

要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：

插入一个或多个氨基酸残基；

删除一个或多个氨基酸残基；

替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。当前第29页\共有85页\编于星期三\6点（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型

可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。当前第30页\共有85页\编于星期三\6点2．找出对所要求的性质有重要影响的位置在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。

当前第31页\共有85页\编于星期三\6点3．预测突变体的结构

根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。当前第32页\共有85页\编于星期三\6点4．构建突变体，获得突变体蛋白

依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。当前第33页\共有85页\编于星期三\6点5．突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。当前第34页\共有85页\编于星期三\6点蛋白质中功能残基的鉴定根据结构信息确定残基的突变突变方法鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定当前第35页\共有85页\编于星期三\6点1．根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。当前第36页\共有85页\编于星期三\6点2．突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测随机突变技术删除分析及连接片段扫描突变

当前第37页\共有85页\编于星期三\6点3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。

当前第38页\共有85页\编于星期三\6点（五）定位突变的应用RNaseT1的结构改造是分于设计中的一个成功实例T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。

当前第39页\共有85页\编于星期三\6点二、蛋白质分子拼接例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。

当前第40页\共有85页\编于星期三\6点英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验(人源化抗体)当前第41页\共有85页\编于星期三\6点单链抗体scFv结构（抗体工程)抗DON单链抗体改体研究DON:小麦镰刀菌毒素当前第42页\共有85页\编于星期三\6点

单链抗体的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL当前第43页\共有85页\编于星期三\6点

单链抗体的改体模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa

<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH当前第44页\共有85页\编于星期三\6点

Linker

XhoⅠSalISalⅠSalⅠXhoⅠ双酶切EcoRIXhoⅠ双酶切EcoRISalI双酶切differentlength连接ＶＨＶＬ

技术路线EcoRI当前第45页\共有85页\编于星期三\6点转化筛选、检测

蛋白质的诱导生成

表达载体构建

感受态细胞的制备纯化亲和力初步测定当前第46页\共有85页\编于星期三\6点

PCR扩增重链、轻链策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2当前第47页\共有85页\编于星期三\6点PCR反应体系及反应条件50L反应体系如下：10×TaqPCRBuffer5µLdNTP(2.5mM)3µLForwardPrimer(20mM)1µLReversePrimer(20mM)1µLTemple1µLrTaq0.3µL

AddddH2Otoafinalvolumeof50µLPCR循环条件为：94℃5min，1个循环；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31个循环；72℃40s，25个循环；72℃7min，1个循环。取PCR产物5µL，1.0％的琼脂糖电泳检测。当前第48页\共有85页\编于星期三\6点VH

和VL的PCR扩增结果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000当前第49页\共有85页\编于星期三\6点

菌落PCR重组子验证123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100当前第50页\共有85页\编于星期三\6点

改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD当前第51页\共有85页\编于星期三\6点

改体抗体的ELISA初步测定312456789101112当前第52页\共有85页\编于星期三\6点单链抗体抗体：是体液免疫应答的主要效应分子。由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。双特异性单链抗体的构建与表达当前第53页\共有85页\编于星期三\6点单链抗体（scFv）：抗体可变区的重链（VH）与轻链（VL）通过一段约15-25个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。

当前第54页\共有85页\编于星期三\6点双特异性单链抗体能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。玉米赤霉烯酮(ZEN)当前第55页\共有85页\编于星期三\6点技术路线

DON和ZEN抗体基因的提取目的基因片段引物的设计

PCR扩增目的片段

制备感受态细胞

酶切目的片段、载体，linker连接

转化连接产物

酶切验证重组子

表达、纯化蛋白当前第56页\共有85页\编于星期三\6点载体的构建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ连接

Linker当前第57页\共有85页\编于星期三\6点PCR扩增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500当前第58页\共有85页\编于星期三\6点PCR扩增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bp当前第59页\共有85页\编于星期三\6点重组验证当前第60页\共有85页\编于星期三\6点PCR验证以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR分析。当前第61页\共有85页\编于星期三\6点双特异性抗体的表达当前第62页\共有85页\编于星期三\6点

我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。

如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。第三节全新蛋白质设计当前第63页\共有85页\编于星期三\6点

蛋白质从头设计概念

从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。

从头设计方法可以生成全新的分子结构。当前第64页\共有85页\编于星期三\6点全新蛋白质设计包括

一、全新蛋白质设计方法二、蛋白质结构的从头设计当前第65页\共有85页\编于星期三\6点

全新蛋白质设计过程设计目标序列生成结构预测合成构建模型检测当前第66页\共有85页\编于星期三\6点（一）全新蛋白质设计程序模拟分析设计实验一、全新蛋白质设计方法当前第67页\共有85页\编于星期三\6点（二）全新蛋白质设计目标的选择依据设计的目的可以分为：从头结构设计从头功能设计当前第68页\共有85页\编于星期三\6点从头结构设计

中心问题：

稳定及独特的三维结构序列；基本障碍：

线性聚合构象熵；解决方法：（1）使相互作用的强度与数目达到最大；（2）共价交叉连接。当前第69页\共有85页\编于星期三\6点从头设计方法包含的步骤1、活性位点分析：对结合位点的具体的化学信息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空间相互关系都必须充分考虑。

2、配体分子构建：采用不同的片段选择和分子构建方法，产生相应的分子结构。

3、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。当前第70页\共有85页\编于星期三\6点二、蛋白质结构的从头设计（一）蛋白质结构的从头设计原则1．二级结构的设计原则α螺旋β折叠片转角2．超二级结构和三级结构的设计原则当前第71页\共有85页\编于星期三\6点α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-当前第72页\共有85页\编于星期三\6点β折叠片

(HPHPH或PHPHP，5-10aa)当前第73页\共有85页\编于星期三\6点转角（Pro、Gly中断α螺旋，Glu中断β折叠）

当前第74页\共有85页\编于星期三\6点蛋白质的几种超二级结构

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β当前第75页\共有85页\编于星期三\6点从头设计的三股式β折叠

从头设计的20个氨基酸残基的三股式β折叠（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白质结构的