现代生物技术课件 5胚胎工程

第七章

胚胎工程（Embryotechnology，

Embryo

engineering）第一节

胚胎工程

Embryoengineering

一、胚胎工程的概念

胚胎工程是通过人工操作胚胎，定向改变动物性状使之为人类造福的一系列生物技术的总称。其主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的技术。

胚胎工程相关基本概念1.超数排卵简称超排指通过给母畜注射适当的激素，维持更多卵泡正常发育而排出更多卵子的过程。2.体外受精,亦称试管动物技术指把体外受精动物的卵子和精子取出在试管内混合，受精而形成胚胎的过程。在哺乳动物，体外受精胚胎一般在体外发育到一定时期后移植到受体雌性动物输卵管或子宫内，妊娠到产仔。3.发育阻断：

在化学组分确定的培养基中，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程,而停顿在某个特定的发育时期.这种现象被称为“发育阻断”。4.嵌合体：

生物学中把在同一个体中由基因型不同的细胞或组织互相接触,且各自独立并存(混合存在)的状态,称为嵌合体。6.胚胎保存：

就是在体外或者体内把胚胎暂时贮存起来而不使其失去活力。7.胚胎干细胞：

也可被称为多能性干细胞，是由哺乳动物早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离的，经体外抑制分化培养后，所获得的具有保持未分化的状态和无限增殖能力的细胞系。无论在体外还是体内环境，ESCs都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

8.转基因动物是通过遗传工程的和发育工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，使外源基因与动物本身的基因整合，并通过相应的动物繁殖育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现的工程化动物。9.动物克隆：

指一个动物经无性繁殖或孤雌生殖而产生出遗传构成完全相同的多个后代动物。10.显微受精：

亦称显微操作协助受精,是指通过对动物精子进行显微操作，以帮助其受精的一系列技术。主要包括：胞质内精子注射、透明带下精子注射及透明带钻洞和透明带部分切口。二、发展历史与意义

早在1891年，英国剑桥大学的赫普（WalterHeape）就在免子身上首次成功地进行了受精卵移植实验。

20世纪30年代，一些学者用实验动物如鼠、兔等作受精卵或胚胎移植的研究并获得成功。以后又在绵羊、山羊、猪、牛和马等家畜进行胚胎移植实验，相继获得成功。

20世纪60年代以来，由于实验技术的突破，如超数排卵、同期发情、胚胎采集、移植方法等研究的进展，使胚胎移植不仅在理论上而且在实践上进入应用阶段。近20年来，胚胎移植技术经过不断改进，已经简单、实用而且规范化，技术程序化。意义1）发挥优良母畜的繁殖潜力,增加优良品种数量。一头优良品种母牛卵巢内有几万个生殖细胞，在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，最终只有一个卵泡成熟并排卵，如果受精也只能生出一只良种牛犊。一只良种母畜一生只可能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。如果能让更多的卵泡成熟排卵，而又让品质平凡的同种母畜“借腹怀胎”，那么，优良母畜可以获得后代的数目至少几十倍。2.促进家畜改良的速度

由于提高了繁殖能力，可以使一头母畜在一个性周期内繁殖更多的仔畜，从而在短期内使优良种畜得到大量繁殖，促进了家畜改良的速度。例子——“世界山羊之王”

波尔山羊的快速繁殖体格高大，四肢粗壮，身体丰满。平均日增重350克，屠宰出肉率可达60%以上。具有适应性强、采食性广、繁殖性能好、肉用性十分显著等特点。（一）胚胎工程研究主要包括：胚胎移植体外受精胚胎克隆胚胎性别鉴定胚胎嵌合显微受精转基因动物技术等。三、胚胎工程的研究内容

（二）胚胎工程技术胚胎工程采用的新技术包括:

胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外受精技术、胚胎培养技术、胚胎移植技术、性别鉴定技术、胚胎冷冻技术等。

1.胚胎移植及其基本程序

（1）概念

胚胎移植俗称“借腹怀胎”，是指于着床前自一母体（供体）收集胚胎，移植到另一母体（受体）内完成妊娠的过程。在畜牧业上，供体一般为优秀母畜，而受体一般为品质较差些的母畜。（2）胚胎移植的基本技术程序

胚胎移植的基本技术程序包括：供体的超排和输精→胚胎的收集（手术法和非手术法）→胚胎的检出和冷冻保存→受体的发情同步处理→胚胎移植（手术法和非手术法）→受体妊娠产仔。

(1).手术法胚胎移植

将同期化处理后的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，把胚胎输入子宫上1/3处。这种方法移卵容易、损伤小、成功率较高。

(2).非手术法胚胎移植

使用类似于人工授精的专用输胚枪，将其直接插入排卵侧子宫角内，注入胚胎。

2.胚胎冷冻保存

要建立胚胎库和长途运送胚胎，需要解决胚胎冷冻保存问题。冷冻保存方法大体可分为缓慢冷冻、快速冷冻、玻璃化冷冻三类。

3.胚胎分割

借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚胎成2、4等多等份，再移植给受体母畜，制造同卵多仔后代的技术。分割前，一般均需先准备好空透明带，将分割后的胚细胞团移入空透明带内。胚胎分割是（1）扩大胚胎利用率的一种有效途径，可以使胚胎移植的胚胎数目成倍增加。（2）可以产生遗传性状相同的后代，因此是一种广义上的克隆技术。

4.胚胎融合

胚胎融合又叫胚胎嵌合，将两个不同品种或不同种（除部分或全部细胞去透明带）胚粘合在一起，或者各自一分为二，然后各取一半，融合成新的胚胎，移植给受体，使之发育成一个胚胎，产生具有杂交优势的新后代——嵌合体。可用内细胞团囊胚注入法，将一个品系的单个卵裂球注入另一品系胚胎的囊胚腔中。胚胎融合

将同一种类的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以获得多个黑白相间的花鼠。将不同种的绵羊和山羊的胚胎融合，可得到拥有绵羊和山羊双重特性的新品种——“绵山羊”。大鼠-小鼠、绵羊-山羊、马-斑马、黄牛-水牛等属间嵌合体动物。意义：1）胚胎融合技术为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段，嵌合体后代可集不同基因于一体，形成具有高度杂种优势的杂合体。2）胚胎融合成倍缩短家畜改良时间，为创造新型的家畜品种提供新的技术手段。

5.卵核移植

就是将优良母畜胚胎的卵裂球分离开来，获得几十个具有优良遗传基因的供体核，然后将这些供体核分别注入一般母体的去核卵子中，产出遗传素质相同的后代。目的是由一个优良胚胎(同卵)生出更多的优良后代，进一步提高优良母畜繁殖潜力。6.动物性别控制与胚胎性别鉴定

性别控制是通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。

性别控制途径:1.X与Y精子的分离；

2.胚胎性别鉴定。1)X-Y精子的分离X-Y精子在物理和化学上存在差异，因此可以采用相应的方法分离。离心法：

X精子DNA含量大于Y精子，因此X精子密度大。优点：时间短；缺点：条件要求精确。电泳分离法：利用表面电荷差异，Y精子正电荷大于X精子，在负极集聚。

2)胚胎性别鉴定Y染色体短臂上一段SRY基因决定人的性别。

SRY基因启动雄性形状的发育，激发下游基因MLS的转录，引起睾酮分泌，形成雄性组织。XX染色体缺少SRY基因，染色体上DSS位点基因转录促进卵巢发育，形成雌性。性别鉴定方法

1.分子生物学方法根据Y染色体上的SRY基因的有无进行鉴别，可以采用PCR或FISH等分子方法进行确定性别。性别鉴定方法2.细胞生物学（组织学）方法胚胎阶段的核型分析，根据检出的XX、XY染色体来进行性别鉴定等。3.免疫学方法

H--Y抗原为雄性哺乳动物细胞膜所特有，检测胚胎细胞膜上是否存在H--Y抗原即可鉴别其性别。

7.体外受精

体外受精就是采取雌性动物的卵子和雄性动物的精子，使其在试管中受精。商品犊牛屠宰前用激素处理，一次有20～50个卵泡发育，可获得20～50个卵母细胞，因而体外受精技术可充分挖掘优良母牛生育潜力。人类试管婴儿。精子的采集与体外获能处理卵子的回收与成熟培养体外受精

8.基因导入

给胚胎注入外源基因，增加新遗传物质，并使之在后代中能稳定表达出来。两个目的:

①加快动物生产性能的改良速度；②实现常规选择和杂交不能实现目标。

9.转基因技术

指将外源基因整合到生物体内，得到稳定表达，并使该基因能够稳定遗传给后代的实验技术。五、

胚胎工程应用（一）试管动物

将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般都在试管内进行，所以称为“试管动物”。也有称为“体外受精动物”。试管动物定义：

利用受精卵体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植获得的各种动物。试管动物的培育流程

精子的采集与体外获能处理卵子的回收与成熟培养卵子与精子的体外受精受精卵的体外发育成胚胎胚胎的移植体内发育与分娩（二）试管婴儿试管婴儿技术的发展历史

1978年7月25日世界上第1例试管婴儿LouisBrown在英国诞生。奠基人为英国妇产科专家Stephone

及胚胎学家Edwards1.试管动物的体外受精

一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至囊胚期阶段。2.人工授精不同于试管动物制备时的人工受精，它不需从供体获得精子和卵子，经过成熟培养后受精。一般情况下，经过超排卵处理的母体动物在停药后24-48小时内有95%的母畜表现发情，在观察到发情的当日上午和下午或夜晚和次日晨进行人工授精两次。1980年6月澳大利亚,1981年12月美国、1983年10月日本1985年4月我国台湾1986年12月香港

我国大陆第1例试管婴儿于1988年3月10日,诞生于北京医科大学第三附属医院妇产科,其创始人为张丽珠教授试管婴儿技术发展的三个阶段

由于体外授精技术方法不同，可分为3种孕育胎儿：第一代传统的体外受精－胚胎移植(IVF－ET)“试管婴儿”，第二代卵胞浆内单精子注射（ICSI）”试管婴儿”，第三代种植前遗传诊断(PGD)“试管婴儿”。

第一代“试管婴儿”

多种激素类药物－－－女方超排卵在阴道超声引导下，经阴道后穹隆穿刺吸卵。取出后的卵子在一定条件下与精子共同培养、受精，经过48小时左右便可发育成早期胚胎。将2-4个胚胎送回母体子宫内。由于都是在玻璃培养皿及试管中进行的，故以这种助孕技术出生的婴儿称——“试管婴儿”。

该技术主要用于因女性导致的不育。当女方卵子不能通过输卵管受精并运送到子宫腔时，“试管婴儿”便成为唯一获得生育机会的选择。对于卵巢功能丧失或切除或有遗传性疾病的患者，可采用供者卵子做“试管婴儿”，对于子宫切除或发育不良的患者，则可取其卵子与丈夫精子进行体外授精后将早期胚胎植入代孕妇女子宫内发育并分娩。第二代“试管婴儿”

第二代是卵胞浆内单精子注射“试管婴儿”(ICSI)与第一代传统“试管婴儿”技术区别在于，它不是将许多卵子与数百万-上亿精子在体外直接混合培养，而在显微镜及微操纵仪下，用特制的微穿刺针将单个精子注射到一个发育成熟的卵子胞浆内，其他过程都与传统“试管婴儿”相同。

为严重的男性不育患者带来了福音

严重的少精、弱精、畸形精子症患者，输精管道先天或后天缺损、阻塞或手术切除造成的阻塞性无精症患者第三代“试管婴儿”

第三代“试管婴儿”技术即是对种植前的早期胚胎进行遗传诊断(PGD)，有问题的胚胎弃之，只把正常胚胎移入子宫内防止遗传病患儿的出生。在胚胎植入母体之前，应用分子学技术或荧光原位杂交方法测定DNA片段或特定染色体,将诊断无遗传病的胚胎移植入子宫，

保证妊娠胚胎正常。试管婴儿技术主要技术步骤超排卵卵泡监测与取卵精子的优选与处理体外受精(IVF)胚胎的体外培养及挑选胚胎移植(ET)移植后护理着床前准备胚胎着床前遗传学诊断(PGD)

透明带下人工受精术(SUZI)

此方法是将单个或多个精子直接注射到透明带下卵细胞膜外的卵黄周隙(PVS),让精卵受精,再移植宫内妊娠分娩。注射精子的数目一般多平均为3-5个精子,因为注射的精子越多,受精率高。此方法对卵的损伤不大，且多精受精率不高，目前已被较多地采用。卵细胞内注射精子受精术(ICSI)此方法是将精子直接注入卵细胞内,省略了受精过程的一系列变化,如精子与透明带的结合、穿透,精卵细胞膜的融合等。有利于受精的完成,特别适用于少弱精患者。而且受精之前无需对精子特殊处理,精子不需要发生顶体反应,并克服了多精受精无法控制问题。该方法对卵的损伤大于上述二种方法。许多学者对ICSI试管婴儿的产科结局畸形率和核型进行研究，发现ICSI和常规体外受精试管婴儿在产科结局上没有差异。

人工受精胚胎的体外培养及挑选

卵子和精子受精后,置于有一定浓度共培养细胞生长的条件培养基中共同培养。胚胎的挑选,大多学者主张精卵受精后经培养液培养2～3天，形成8～16细胞胚卵，然后根据胚胎评分标准对胚胎进行评分，挑选Ⅰ-Ⅱ级胚胎进行移植。

胚胎评分标准Ⅰ级:细胞大小均匀,形状规则,胞质均匀清晰,无碎片。Ⅱ级:细胞大小略不均匀或形状略不规则,胞质有颗粒现象,碎片<20%。胚胎移植(ET)大多数主张在8～16细胞时移植。即受精卵培养2～3d移植,为控制多胎妊娠,所以一般移植2～4个Ⅰ-Ⅱ级胚胎较合适。移植操作：用很细的导管经宫颈进入子宫，然后将胚胎经过该导管注入宫腔内。代理母亲代理母亲（Surrogatemother）指出借或出租自己子宫代替他人生育后代的妇女。在某些发达国家已发展成为一种新兴的行业。愿意出租子宫的妇女情况：

——希望体验怀孕和生孩子的滋味；

——由于曾经过流产，包着“赎罪”心理想替别人生一个孩子

——出于经济考虑。胚胎着床前遗传学诊断(PGD)着床前遗传学诊断是避免遗传病儿出生,达到优生目的的重要手段。PGD是在胚胎移植到子宫之前确定其遗传物质是否正常；卵裂期,对受精后第3天8～12细胞阶段的卵裂球进行活检;胚期:对滋养层细胞活检可取得较多的细胞供遗传学诊断,增加了诊断的可靠性。目前PGD方法主要有两种:聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)技术。试管婴儿技术的展望

IVF-ET技术已日渐完善,适用于各种不孕症的治疗,但成功率有待进一步提高。可优选促排卵药物；不断改进体外受精技术；改善胚胎体外培养条件；进行良好的胚胎体外培养;对胚胎进行着床前遗传学诊断,避免遗传病儿出生；随科学技术水平不断提高,能使IVF-ET妊娠成功率进一步上升,为不孕家庭带来幸福和欢乐。结语

生殖使生命过程得到无限的延续，同时，有性生殖产生的后代具有双亲的优点，使生物体不断进化。由于有了生命的存在，从而有了丰富多采的世界。人类辅助生育技术为广大不育患者带来了极大的福音，也给人类带来了新的思考！话说克隆

一、胚胎分割二、胚胎细胞克隆三、体细胞克隆四、转基因动物克隆话说克隆胞胎分割是克隆吗？体细胞克隆？胚胎细胞克隆？人类胚胎克隆？转基因动物克隆？从多胞胎现象谈起正常的胚胎发育动物克隆

是指由一个动物经无性繁殖或孤雌生殖而产生出的遗传构成完全相同的多个后代动物。动物克隆的方法

目前看，比较现实可行的生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。