基因工程的基本操作程序白齐

基因工程的基本操作程序白齐第一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1.目的基因主要是指：

_______________________编码蛋白质的结构基因2.获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成一、获取目的基因第三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五①概念：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库（1）从基因文库中获取目的基因提取某种生物的全部DNA一定大小的许多DNA片段重组DNA分子(携带目的基因)限制酶与载体连接受体细胞(基因文库)筛选出产生特定性状的受体细胞导入外源DNA扩增目的基因分离第四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五②种类1.基因组文库:2.部分基因文库（如cDNA文库）基因文库中包含了一种生物的所有基因,这种基因文库叫做基因组文库基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.优点：操作简单缺点：工作量大，盲目性强③从基因文库中获取目的基因第五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五基因组文库与部分基因文库的关系第六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五？为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取可以吗？如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段等情况，往往就需要构建基因文库。如果所需要的目的基因序列已知，可以通过PCR等方式获得，则不需要构建基因文库。寻根问底第七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五巩固训练1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（）

A.染色体DNA

B.线粒体DNAC.总mRNA

D.tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（）A.某生物的全套基因就是一个基因文库B.将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C.含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D.含有多种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC第八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五（2）利用PCR技术扩增目的基因1.PCR——多聚酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。2.原理：DNA复制要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物3.前提：第九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五四种脱氧核苷酸

一对引物：耐热的DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

4.条件：与目的基因的起始段互补。5.方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）6.结果：指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增第十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五7.过程：变性、复性、延伸三步曲①变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA②复性：冷却至50～60℃两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合③延伸：加热至70～75℃溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性复性延伸第十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五DNA复制PCR技术场所解旋方式温度条件酶特点结果联系PCR技术扩增与DNA复制的比较细胞内温和的条件需控温,在较高温度下进行DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外细胞内(主要在细胞核内)大量的DNA片段(基因)形成整个DNA分子耐热的DNA聚合酶(Taq酶)DNA聚合酶、解旋酶等①模板:均需要

作为模板进行物质合成②原料:均为四种

.

③酶:均需要

进行催化④引物:均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

脱氧核苷酸DNA聚合酶脱氧核苷酸链第十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C巩固训练第十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五

2.在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是()①双链DNA分子为模板

②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物⑧温度变化⑨恒温

A.①③④⑦⑧⑨

B.①②④⑥⑦⑧

C.①②⑤⑥⑦⑨

D.①③⑥⑦⑧D第十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五（3）人工合成1.逆(反)转录法2.化学合成法补充：基因的结构非编码区非编码区编码区内含子原核细胞真核细胞外显子RNA聚合酶结合位点启动子终止子转录终止第十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五真核细胞的基因结构内含子外显子真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列:有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区上游编码区下游第十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五外显子对应的RNA序列内含子对应的RNA序列成熟的mRNA转录编码区非编码区非编码区外显子内含子真核生物的转录过程末成熟的mRNA剪接内含子(有关酶的作用下)第十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五编码区非编码区非编码区DNA聚合酶有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子(以真核生物的逆转录过程为例)1.逆(反)转录法第十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五求异思维

你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？cDNA合成过程是：①反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。②核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。第十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2.化学合成法蛋白质的氨基酸序列mRNA的核甘酸序列基因的核苷酸序列目的基因DNA合成仪合成推测推测——根据已知的氨基酸序列合成DNADNA合成仪第二十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五一、目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成:逆(反)转录法化学合成法种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库课堂小结：（种类最多）（数量最多）（针对性最强）第二十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1、在已知氨基酸序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是()A、化学合成法

B、基因组文库法C、cDNA文库法

D、多聚酶链式反应2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD巩固训练第二十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五二、基因表达载体的构建

——基因工程的核心1、目的：①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够表达和发挥作用。第二十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五二、基因表达载体的构建——核心（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子(重组质粒)限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同2.过程:目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。第二十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五3、基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点启动子目的基因复制原点终止子标记基因表达载体表达载体的模式图表达载体第二十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五启动子目的基因复制原点终止子标记基因表达载体表达载体的模式图终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，使转录终止。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而筛选出含有目的基因的受体细胞。启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。第二十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了

、

、

三部分结构②用到的工具酶：既用到

切割载体，又用到

将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是

。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意：目的基因启动子终止子限制酶DNA连接酶磷酸二酯键第二十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以，因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。第二十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1.(多选)一个基因表达载体的构建应包括()A．目的基因B．启动子

C．终止子D．标记基因2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是()A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别ABCDA巩固训练第二十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五第三十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五受体细胞具备的条件：

没有与运载体相同的质粒或没有与运载体质粒相同的标记基因。三、将目的基因导入受体细胞(一)转化：(二)方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法(常用)基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+法处理法(感受态细胞法)目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第三十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法第三十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五（1）农杆菌转化法(常用)①农杆菌：

植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中，使植物形成肿瘤。

此糖类和酚类物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗?第三十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五（1）农杆菌转化法

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。②原理：第三十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第三十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物第三十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五（3）花粉管通道法适用于被子植物我国科学家独创的一种方法,我国的转基因抗虫棉就是用这种方法获得的第三十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。滴加目的基因溶液（3）花粉管通道法第三十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？受精卵具有体积大,易操作,经培养可直接表达性状的优点。而动物体细胞的全能性受限。第三十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体受精卵显微注射移植到子宫新性状动物早期胚胎培养2.将目的基因导入动物细胞第四十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五常用法：Ca2+处理细胞法

(Ca2+增加细菌细胞的通透性)常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞细菌能够吸收DNA的状态第四十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（）

A．结构简单、操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有（）①大肠杆菌②枯草杆菌③支原体④动植物细胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是()A.人工合成基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C巩固训练第四十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是()①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A．①②B．②③C．③④D．①④C5.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是()①农杆菌转化法②基因枪法③花粉管道法④显微注射法⑤胚胎移植⑥DNA分子杂交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C第四十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功(一)分子水平检测(二)个体水平鉴定1.检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因2.检测目的基因是否转录出了mRNA3.检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定,抗病鉴定,活性鉴定等方法：DNA分子杂交(DNA和DNA)方法：分子杂交(DNA和mRNA)方法：抗原-抗体杂交第四十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因。①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②

将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③

使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）分子检测第四十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。第四十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五DNA附着在膜上硝酸纤维素膜加探针报告基因（含荧光素分