基因工程第四章目的基因的分离和合成

基因工程第四章目的基因的分离和合成第一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第四章目的基因的分离与合成获得目的基因的方法：限制酶直接分离从基因组文库中筛选逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选人工合成PCR扩增基因改造

第二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第四章目的基因的分离与合成第一节限制酶直接分离一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基因的制备对已定序列的DNA分子只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。对已知定位的目的基因只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次即可获得目的基因。第三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第一节限制酶直接分离二、用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备采用鸟枪法（shotgun）：从细菌细胞中分离细菌染色体用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体细胞转化子的选择第四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）第五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26鸟枪法操作的改进

使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率

使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA

第六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离

2.0kb1.6kb1.8kb第七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构第八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库的基本概念基因库（genepool）

特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（genelibraryorgenebank）

从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）

存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：

cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）

第二节建立基因组文库第九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库第二节建立基因组文库第十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆第二节建立基因组文库第十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选第十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库的构建程序基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段第十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库的构建程序基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！第十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26基因文库的构建程序载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体l-DNA由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒10kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌第十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第二节建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤1、利用λ噬菌体获得目的基因的DNA片断基因组DNA片段化的方法物理学方法：机械力和超声波生物化学方法：限制酶（四个核甘酸序列识别位点的酶）与噬菌体克隆载体重组，体外包装成噬菌体颗粒转染宿主菌筛选培养第十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第二节建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤2、利用Cosmid基本与用λ噬菌体载体构建基因组文库相似。有如下不同：制备基因组DNA须特别小心必须保证DNA分子尽可能大载体的处理比较简单连接重组时，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上包装转染后在平板上出现的转化菌落，不是嗜菌斑第十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第二节建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤3、利用YAC选用限制酶EcoRI和BamHI对pYAC4载体作双酶消化选用适当的方法制备生物体完整的染色体DNA，并将其片段化收集纯化大片段DNA，并与YAC臂连接转化去壁酵母细胞，利用存在于两臂上的选择标记，筛选含有YAC两臂的酵母细胞第十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第三节cDNA基因文库的构建一、cDNA基因文库的概念某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA基因文库cDNA序列只与基因的编码序列有关，不能反映基因的内含子，也不能反映基因的转录启动子、终止子等非转录序列cDNA基因文库可分为表达型和非表达型表达型cDNA文库的构建：λgt11非表达型cDNA文库的构建：λgt10第十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26第三节cDNA基因文库的构建二、cDNA基因文库的构建细胞总RNA的制备及mRNA的分离cDNA第一条链的合成双链cDNA的合成cDNA与载体的连接，重组到相应的载体上，导入受体细胞增值第二十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建细胞总RNA的制备及mRNA的分离总RNA：mRNA、tRNA、rRNAmRNA的分离纯化利用真核生物mRNA其3‘末端的poly（A）尾巴与oligo（dT）配对特性，制备oligo（dT）型纤维素亲和层析柱第二十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建以mRNA分子为模板，合成cDNA分子第一链Oligo（dT）引导的cDNA合成法随机引物引导的cDNA合成法第二十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建双链cDNA分子的合成自我引导合成法碱处理mRNA-cDNA杂交分子，降解mRNA单链cDNA在3‘端易发生自身环化形成发夹结构为cDNA第二链的合成提供引物在klenow酶的作用下合成cDNA第二链用S1酶切割除去单链发夹结构第二十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建双链cDNA分子的合成置换合成法RNA酶H和E.coliDNA聚合酶I混合处理mRNA-cDNA杂交分子，RNA酶H在杂合双链mRNA链上产生缺口并形成部分cDNA单链区DNA聚合酶I以残存的mRNA作为引物合成cDNA第二链T4-DNA连接酶修复缺口第二十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建双链cDNA分子的合成引物合成法在第一链合成完毕后，变性残留的mRNA，用末端转移酶在cDNA游离的3‘羟基端添加同聚物（dC）末端将其与人工合成的oligo-dG退火，形成引物结构在klenow酶的作用下，合成第二条cDNA链。PCR法第二十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收第二十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26二、cDNA基因文库的构建双链cDNA克隆的筛选探针原位杂交法差示杂交法第二十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构

细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因第二十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26三、PCR扩增法PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物PCR法定向扩增目的基因的基本原理第二十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26四、基因的化学合成DNA的化学DNA合成仪酶促法全片段酶促连接法人工合成组成一个完整基因的所有寡核甘酸片段，相邻的片段间有4-6个碱基的重叠互补相互互补的寡核甘酸片段复性，形成双链寡核甘酸片段用T4连接酶连接酶促填充法第三十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26四、基因的化学合成DNA的化学DNA合成仪酶促法全片段酶促连接法酶促填充法合成目的基因其中的一些片段，在这些相邻的片段的3‘端有一短的序列互补复性形成模板用klenow酶去填补互补片段间的单链区域第三十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26化学合成法的基本战略全基因合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%第三十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域第三十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26化学合成的单元操作

化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的第三十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因

设计新型基因

制备探针、引物、接头

如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等

第三十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26目的基因的分离目的基因的功能克隆根据特异蛋白分离目的基因基本过程：分离特异蛋白，测定特异蛋白的氨基酸顺序，推测该蛋白的核苷酸序列，合成探针分离特异蛋白，作为抗原制备抗体，筛选cDNA表达文库第三十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26目的基因的分离目的基因的功能克隆根据特异蛋白分离目的基因注意事项：合成的探针必须特异的识别目的基因，充分考虑遗传密码的简并性利用抗体筛选目的基因时，应构建cDNA的表达文库第三十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26目的基因的分离目的基因的功能克隆功能互补法克隆基因利用被克隆的DNA片断与寄主细胞的染色体DNA在功能上的互补性来进行目的基因的直接分离酵母基因组酶切DNA片断λ噬菌体载体营养缺陷型菌株＋基本培养基重组体第三十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26实例：基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因组文库DNA→转化E.coli（无纤维素酶活性）→转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈→纤维素酶基因

优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。

缺点：适用范围较窄。

必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。第三十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/261.遗传互补法1)

原理当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。i.营养缺陷型受体细胞+外源DNA→转化细胞涂布在合成培养基上→原养型细胞生长ii.受体细胞（无某种表型）+外源DNA→转化细胞涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞iii.虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。第四十页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/262)分离步骤分离基因组文库重组DNA分子→转化适当宿主细胞→涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子→再转化相同受体细胞→高频转化子→基因的进一步证实和鉴定

重组DNA转化细胞SDS→出现新蛋白质带原载体转化细胞(一)分别制备无细胞抽提物酶活测定→酶活性出现非转化细胞（二）免疫分析→与特定抗原反应第四十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/262．核酸杂交法1)原理利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列）优点：不需要基因表达必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增

2)核酸探针种类

i.DNA探针:分离自某一种生物ii.寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测第四十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN

对应mRNAN：ACGT/U

CAN-AAP-GTP-CTP-CG

探针序列Q：CT/UP：AG

32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补*选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。**这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。iii.cDNA探针:利用特异性mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA混合物反转录而成iv.PCR探针v.RNA探针:由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得第四十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26

3)分离步骤

基因(基因组或cDNA)文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→作斑点杂交阳性克隆Southern杂交以确认杂交结果→DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物3.免疫法1)原理

外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应,然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA第四十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达。*外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显子，这些序列可以插入E.coli表达型载体。必备条件：待分离基因的表达产物—蛋白质必须纯化和用于制备相应抗体。2)

分离步骤基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑点（阳性克隆）→进一步证实：分离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；分离重组DNA，检测插入片段大小，测序等。第四十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26目的基因的分离目的基因的序列克隆法根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因用核酸探针进行杂交筛选：根据已知序列合成相应探针，再与基因组文库的克隆进行杂交，筛选阳性克隆，最后分离鉴定表达序列标签（EST）法分离目的基因表达序列标签（expressedsequencetagEST）:是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列。第四十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术差别杂交（differentialhybridization）法应用前提：需要拥有两种不同的细胞群，即在一个细胞群中目的基因能正常生长，而在另一细胞群中目的基因不表达。Fig4-21减法杂交（subtractivehybridization）技术mRNA减法杂交fig4-22基因组DNA减法杂交fig4-23第四十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26利用差示分析法分离目的基因克隆mRNA差别显示技术（DD-PCR,DDRT-PCR）

fig4-24抑制性减法杂交（SSH）技术该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的革命性方法，特别适宜于那些差异表达量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。待测ds-cDNA（testercDNA）和驱动ds-cDNA（drivercDNA）fig4-26第四十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023/5/26

4.染色体巡查法(chromosomewalking)1)原理

利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两末端片段为探针选择对应重组DNA，此次筛选的DNA插入片段仅以一端为探针，继续和重复该过程，直至筛选到目的基因优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序列测定十分有用缺点：工作量大，鉴定困难，当巡查高等真核生物染色体时，重复DNA序列区域难以跨越。必要条件：两基因间距离应清楚。*该法的两大难点：限制酶图制作和末端片段探针制备。前者可用改进的载体，后者可用RNA聚合酶合成末端探针2)操作步骤第四十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期五2023