格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响

格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响【摘要】目的：探讨格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响.方法：取分离鉴定的Wister大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体悬浮液,加入到含有K+和KATP通道阻滞剂ATP的待测溶液中,再按如下分组进行药物干预,即空白对照组、特异性mitoKATP激活剂二氮嗪组、Dia+Glip组,即刻检测溶液在3min内光散射值的变化,以此作为反映线粒体体积变化的指标.结果：各组线粒体体积均随时间增大,Con组增加速度极慢,Dia组最快,而Dia+Glip组则介于两者之间.不同浓度Glip均能使两种大鼠线粒体体积增加速度减慢,高浓度作用更明显；相同浓度Glip对不同大鼠组的影响程度不同,对糖尿病GK大鼠的影响明显弱于正常大鼠.结论：Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱.相当于临床治疗中血药浓度峰值的Glip浓度虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿病大鼠心肌mitoKATP无显着影响.

【关键词】格列吡嗪糖尿病心肌线粒体ATP敏感性钾通道

0引言

磺脲类药物因为高效的降糖作用而广泛应用于2型糖尿病的治疗.它主要通过结合胰岛β细胞膜上磺脲类药物受体引起细胞膜上ATP敏感性钾通道关闭而发挥作用.但研究证实大部分磺胺类药物也能关闭心血管组织的KATP［1］.而后者在心肌缺血时的激活对于启动心肌缺血预适应，降低缺血对心肌的损伤发挥着主要作用,并且线粒体ATP敏感性钾通道相对于细胞膜ATP敏感性钾通道所起的作用更重要,mitoKATP是IPC的最终效应器［2-3］.目前已明确磺脲类药物格列吡嗪对心血管组织sarcKATP有阻滞作用,但少见其对心血管mitoKATP直接影响的报道.我们应用线粒体悬浮液定量光散射测定技术研究Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP的影响，探讨Glip对缺血性心肌的安全性、指导临床对缺血性心脏病患者降糖药的选择.

1材料和方法

材料8~9wk雄性Wister大鼠和糖尿病GotoKakizaki(GK)大鼠各20只，体质量220~250g(上海斯莱克实验动物有限公司)；Glip纯品；蔗糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、琥珀酸钠、丙二酸、延胡索酸；蛋白酶；牛血清白蛋白；二甲亚砜；HEPES，ATP公司；Percoll；二氮嗪，鱼藤酮、寡霉素；高速冷冻离心机；723型可见分光光度计.

方法

线粒体制备大鼠禁食过夜,断头处死,迅速取出心脏.依据Riess等［4］的方法提取线粒体,略作改动,简述用少量冰预冷分离介质(250mmol/L蔗糖,10mmol/LHEPES,5mmol/LKEGTA,用NaOH调pH至)漂洗心脏,在含1g/L蛋白酶的分离介质中剪碎心脏至肉糜状,分离介质用5g/L牛血清白蛋白调整至倍体积,用匀浆器制成匀浆液,1700g离心4min,取上清液9000g离心5min,将沉淀吹打重悬浮于分离介质中,2300g离心2min,收集上清液,9000g离心5min,得到线粒体沉淀,将沉淀重悬浮于不含KEGTA的分离介质中.采用自发形成Percoll密度梯度的方法进一步纯化线粒体.最后将所得线粒体沉淀以蛋白浓度35~40g/L悬浮在不含KEGTA的分离介质中,冰浴中保存备用.以上操作均在0~4℃进行,从动物处死到首次离心间隔少于4min.参照Castilho等［5］方法，用测定线粒体内膜关键酶琥珀酸脱氢酶活性法进行线粒体鉴定.双缩脲法测定线粒体蛋白浓度.

线粒体体积测定用定量光散射技术测定线粒体体积变化.当线粒体悬浮液中线粒体蛋白浓度为g/L时,在经过蛋白浓度无限大时吸光度值校正后,线粒体悬液光散射值β与溶液在520nm，25℃的吸光度值的倒数呈线性相关［4］.因此反映线粒体体积变化的线粒体悬液β值可由这两个吸光度值计算所得［6］.实验中线粒体悬液为含K+待测溶液,包括120mmol/LKCl，10mmol/LHEPES，mmol/LEGTA，10mmol/L琥珀酸盐，mmol/LMgCl2，5mmol/L磷酸盐，5μmol/L鱼藤酮，μmol/L寡霉素，200μmol/LATP(KATP阻滞剂),取分离鉴定的Wister大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体,加入到上述待测溶液中,再按如下实验分组进行药物处理,即刻用723型可见分光光度计监测溶液3min内在520nm，25℃的吸光度值变化,然后换算成光散射值β.实验数据以线粒体悬液光散射值变化百分比表示Glip对线粒体体积变化的影响程度.β%=Δβ(Glip)/Δβ(Dia)=［β(Glip)-β(Con)］/［β(Dia)-β(Con)］×100％［4］,其中β(Con)，β(Glip)，β(Dia)分别是实验特定时间点对照组、Glip组和二氮嗪组β值.

动物分组将Wister大鼠和GK大鼠各分4组.①二氮嗪组：加入特异性mitoKATP激活剂二氮嗪；②Glip低剂量组：二氮嗪后加入5μmol/LGlip；③Glip高剂量组,二氮嗪后加入50μmol/LGlip；④空白对照组：加入相应体积的含K+待测溶液.其中Glip和二氮嗪溶解于mL/LDMSO中,在本实验条件下,mL/LDMSO对实验结果无影响.

统计学处理：数据以x±s表示,应用软件进行统计学分析,两组间均数比较应用t检验,两组以上均数比较应用方差分析,方差齐性用最小显着差法(LSD)检验,为差异具有统计学意义.

2结果

各组大鼠心肌线粒体体积随时间的变化各组的线粒体悬液光散射值(β值)均随时间有程度不等升高.各大鼠心肌线粒体悬液光散射值β在空白对照组上升速度非常缓慢,在加入二氮嗪后速度明显加快.两者在Wister大鼠实验结束时β值分别为±，±,差别具有显着统计学意义；两者在GK大鼠实验结束时β值分别为±，±,差别具有显着统计学意义；两者3min时间点β值相对于实验起始点增加百分比在Wister大鼠分别是%和%,差别具有统计学意义，在GK大鼠分别是%和%,差别具有统计学意义.

对大鼠心肌线粒体体积变化的影响加入5，50μmol/LGlip后，线粒体体积增加速度减慢,线粒体悬液β值随实验时间延长较二氮嗪组下降明显.图3为实验各组在加入药品后120s时的β%值,不同浓度Glip均会使Wister和GK大鼠心肌线粒体体积增加速度减慢,高浓度组的影响较低浓度组更明显,差异具有显着统计学意义.在不同大鼠组别中,相同浓度的Glip降低心肌线粒体体积增加速度的程度不同,对GK大鼠的影响明显弱于Wister大鼠组,并且随着Glip浓度增加,两者之间的差异也变大.

3讨论

我们采用线粒体悬液定量光散射测定技术研究了Glip对大鼠心肌组织线粒体KATP通道的影响.发现在含有mitoKATP抑制剂ATP的大鼠心肌线粒体悬液中,线粒体体积增加缓慢,而加入特异性mitoKATP激活剂二氮嗪后线粒体体积急剧上升,这与Costa等［6］的研究结果相一致,表明在本实验条件下线粒体体积的增加是mitoKATP开放的结果.

我们发现加入Glip使二氮嗪引起的线粒体体积增加程度明显下降,并且呈浓度依赖性,即高浓度组的作用较之低浓度组更明显,从而证实Glip能够关闭mitoKATP.由于mitoKATP在缺血预适应保护心肌中发挥着不可替代的作用,因而关于其分子结构的研究报道很多,最近Cuong等［7］发现磺脲类药物受体2而非SUR1参与了大鼠心肌mitoKATP的构成,并且已有研究表明Glip虽然亲和力很低，也能够与心血管组织sarcKATP上的SUR2亚单位结合.因此Glip关闭大鼠心肌mitoKATP可能是它与mitoKATP上SUR2亚单位结合的结果.Glip虽可关闭mitoKATP,但它的这种作用较之格列本脲明显弱.既往研究表明50μmol/L格列本脲几乎完全阻断mitoKATP的开放,而本实验结果显示50μmol/LGlip仅能使mitoKATP活性下降约一半,显示出Glip对KATP通道的选择性明显高于格列本脲,对心肌mitoKATP的亲和力极低,即使在相当于临床治疗中血药浓度峰值的浓度下它对心肌mitoKATP的作用也很微弱.这可以解释Flynn等［8］的研究结果,该研究发现Glip并不影响麻醉大白兔的心肌缺血预适应.

我们同时也比较了Glip对正常及2型糖尿病大鼠心肌组织mitoKATP的影响,发现相同浓度的Glip对糖尿病大鼠心肌mitoKATP的关闭作用较之正常组明显减弱,提示糖尿病状态下心肌mitoKATP对Glip的反应性降低,推测具体机制有：糖尿病时氧化应激和蛋白糖基化使得mitoKATP对刺激的敏感性下降［9-10］,糖尿病时细胞代谢水平的降低也减弱了mitoKATP对药物的反应能力.并且研究也发现,Glip在相当于血药浓度峰值的浓度下,对正常大鼠心肌mitoKATP有轻微关闭作用,但对糖尿病心肌mitoKATP不产生具有统计学意义的影响.

总之,通过以上研究表明,Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱,因而在有必要进行明确其中机制研究的同时,也必须认识到在非糖尿病状态下得出的关于Glip对心肌缺血预适应影响的结果并不适用于糖尿病状态.相当于血药浓度峰值的Glip虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿病大鼠心肌mitoKATP无显着影响,这提示我们临床治疗剂量的Glip对于缺血心肌可能是安全的.

【参考文献】

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