细胞生物学技术课件 2015免疫细胞化学

了解一个基因在组织和细胞里是否表达、以及表达水平的高低,可以用的技术有哪些？WesternBlotting?RT-PCR?定位？哪种细胞?哪些细胞器?

细胞化学技术

cytochemistry

组织化学技术histochemistry

联系方式：李贵苹电话：776402地址：西7号楼103邮箱：pingerli@126.com什么是细胞化学？检测和分析细胞的化学组成细胞打碎，化学成分释放。不是细胞化学技术！什么是细胞化学？在原位检测和分析细胞的化学组成，保持原有结构和位置。哪种细胞?哪些细胞器?

细胞化学技术

在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应在原位确定化学成分在组织、细胞和细胞器各个水平的的分布情况及这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术，用以阐明细胞化学成分、结构和功能的关系。

1.保持细胞、组织的固有形态和结构；2.防止细胞的自溶，以防抗原扩散；3.细胞内蛋白质凝固;4.保持组织或细胞化学成分的某些属性,如抗原性或核酸杂交活性。固定（Fixation)特点1.原位：怎样做到组织/细胞的原位？方法：固定剂Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。

Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。

根据组织类型，选择合适的固定剂

特点2.细胞化学反应及可见性

酶细胞化学技术免疫细胞化学技术

原位杂交技术放射自显影技术酶+底物反应显色反应抗原+抗体反应显色反应放射性同位素衰变和射线的释放反应感光核酸杂交反应显色反应定性、定位分析定量分析特点3.细胞化学反应的观察显微镜

流式石蜡包埋或冷冻切片（保持原位）组织细胞固定化学反应显色反应

细胞化学技术通用流程3.技术的灵敏度和特异性、问题的解决（troubleshooting)灵敏度(Sensitivity):是否有信号特异性(Specificity):信号是否特异2.技术的基本原理1.技术的适用范围学习和应用细胞化学技术应注意的方面免疫细胞化学技术

是利用免疫化学反应来定位组织细胞中特异大分子的一类技术。Immunocytochemistry(ICC)免疫组织化学（免疫组化)Immunohistochemistry(IHC)1.组织细胞中的特异分子均可作为抗原,因而该技术可用来检测几乎所有大分子的定位。应用范围：2.也可用在其他细胞化学技术的显示反应中。

一、抗原

二、抗体

三、免疫反应的特异性

四、免疫细胞化学反应

五、标记物及其在光镜和电镜下可见性第一节免疫细胞化学原理

凡能刺激机体产生抗体并能与抗体特异结合的物质称为抗原。

一、抗原

细胞中具有抗原性的化学成分有：

蛋白质多肽脂蛋白多糖脂多糖糖蛋白核蛋白等

这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗?

从生物学功能来看都包括了哪些物质?

酶、受体、抗体、细胞外基质、激素、细胞结构蛋白、病原体等它们都可以用免疫细胞化学技术来检测。

二、抗体*Fab片段：结合抗原决定与抗原结合的特异性（抗体活性）

*

Fc片段：结合抗种属抗体同种型抗原性的抗原决定簇，（“抗原性”活性）

FcFab两种“结合力”识别一抗的种属特异性，并能够因此结合一抗,称为二抗(抗种属抗体)。“一抗、二抗”二抗(secondaryantibody)一抗(primaryantibody)：识别特异抗原抗原(antigen)

两类抗体

多克隆抗体—

抗血清，是用提纯的抗原免疫动物后从动物血清制备得到的。特点：可自行制备；灵敏度高；特异性较差

单克隆抗体—

由单个产生特异抗体的Ｂ淋巴细胞扩增的细胞克隆产生的抗体。特点：特异性高

兼顾灵敏度，特异性免疫反应的特异性表现在：

抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体产生对其特异的抗体并与抗体发生反应

抗体针对某种抗原分子而产生，特异地识别该抗原并与其结合三、免疫反应的特异性

组织抗原＋标记抗体标记的抗原抗体复合物免疫反应显色反应

四、免疫细胞化学反应

把组织细胞中的特异分子作为抗原,用各种在显微镜下可见的标记物标记特异抗体或者标记抗原抗体复合物，使免疫化学反应具有可见性,间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。

免疫细胞化学反应原理

直接法直接标记第一抗体

两种方法：直接法和间接法

间接法标记第二抗体或复合物直接法与间接法

直接法组织抗原直接与标记的特异抗体（一抗）反应间接法组织抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应★不必对一抗作标记★避免标记造成对抗体与抗原结合的影响★标记物多，信号增强

直接法直接标记第一抗体

间接法标记第二抗体或复合物五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性

标记物

使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质。1.荧光2.酶3.亲和物质4.胶体金颗粒

免疫荧光技术荧光2.酶3.亲和物质4.胶体金颗粒根据标记物，免疫细胞化学技术可分为：免疫酶技术免疫亲和技术免疫胶体金技术

免疫荧光技术将荧光素作为标记物，使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。

（一）免疫荧光技术

荧光素：能够产生荧光并能作为染料的一类化合物。在激发光的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光（发射光），在显微镜下可见，并随照射停止而消失。荧光显微镜：荧光显微镜的光源提供各种激发光，使受检标本内的荧光物质发出发射光.（应用荧光染料时都需要知道2个波长：excitationwavelength,emissionwavelength)

如:１.异硫氰酸荧光素(

FITC)

ex:490nm,es:520-530绿色

２.四乙基罗达明

ex:570nm,es:595nm明亮的橙色

３.四甲基异硫氰酸罗达明ex:550nm,es:620nm橙红色

４.藻红蛋白(PE)

多种，橙黄-红色

荧光素

海马细胞

微管蛋白绿色(胞体、树突)

轴突终末蛋白红色(突触)

共定位黄色A549细胞人骨肉瘤细胞牛肺动脉内皮细胞红色：线粒体绿色：溶酶体蓝色：细胞核红色：线粒体绿色：内质网紫色：细胞膜红色：线粒体绿色：高尔基1.双重或多重标记，同时比较不同分子的位置及量的关系。2.双重或多重标记，同时染色细胞器和感兴趣分子，可显示分子的亚细胞定位信息。3.根据荧光素的强度，进行半定量分析。免疫荧光技术优点：

是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位。普通光学显微镜即可观察

（二）免疫酶技术酶抗原一抗二抗酶标二抗酶—抗酶抗体复合物抗酶抗体酶标抗体法抗酶抗体法

复合物法酶标记的三种形式：信号的放大一抗二抗抗酶抗体一抗二抗抗酶抗体复合物一抗二抗

常用的标记酶：

辣根过氧化物酶

2.碱性磷酸酶外源的酶，与细胞内的内源酶应该有明显区别.两种方法：

(1)过氧化物酶标记抗体

(2)过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）

１.辣根过氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）

底物：DAB(二氨基联苯胺)光镜下：棕黄色;DAB经锇酸固定后能生成锇黑,电镜下呈现高电子密度.

HRP

H2O2

H2O

nDAB锇酸

锇黑（高电子密度）DAB氧化聚合物(棕黄色)

显示辣根过氧化物酶（HRP）

２.碱性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）两种方法：

(1)碱性磷酸酶标记抗体

(2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）

b.底物：萘酚衍生物，捕捉底物：固红或固蓝产物：红或蓝色偶氮色素

APBCIP蓝紫色色素NBT

a.底物:吲哚酚酯BCIP，捕捉底物：四唑盐NBT，产物：蓝紫色

显示碱性磷酸酶(AP)

1.反应后标本材料可长期保存。2.观察定位信息时，可观察感兴趣分子在细胞整体中的相对定位，颜色对比清晰。3.同时观察阳性信号和阴性信号。4.能用于电镜观察。免疫酶技术优点：亲和物质：具有多价能力的物质，与另一种亲和物质有高度亲和力，又能与抗体、蛋白质及各种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合。最常用的亲和物质系统：

1、生物素（biotin）-亲和素（avidin）结合能力强，结合不可逆

2、葡萄球菌A蛋白-免疫球蛋白IgG

（三）免疫亲和技术通常在光镜下观察

(1)标记亲和素－生物素技术（Labeledavidinbiotin,LAB）

标记链球菌亲和素-生物素技术

（LabeledStreptoavidinbiotin,LSAB）

(2)桥式亲和素－生物素技术（Bridgedavidinbiotin,BAB）

(3)亲和素－生物素-酶复合物技术

（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系统标记技术的基本方法生物素化酶生物素化抗体亲和素—生物素

—酶复合物生物素亲和素

标记链球菌亲和素-生物素技术

Labeledstreptoavidinbiotin（LSAB)①→②→③→Hsp90在肝癌组织中的表达(LSAB法)

亲和素－生物素-酶复合物技术（ABC）

亲和素-生物素-HRP①一抗②二抗生物素化③

复合物抑癌基因产物P16位于垂体腺瘤细胞核

葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)

◆是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白简称为A蛋白或蛋白A

◆SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG呈非特异性结合又能与标记物结合

经标记的SPA可代替相应标记的二抗2.葡萄球菌A蛋白与IgG系统（四）免疫胶体金技术以电镜下可见的胶体金作为抗体或蛋白Ａ的标记物，间接显示组织细胞中特异分子的技术。

通常在电镜下观察

金标抗体或金标A蛋白

1、亚细胞定位（超微结构定位）。2、采用不同大小的金颗粒(通常5-20nm)，标记不同抗体或A蛋白，达到双重甚至多重标记，定位多种抗原的目的。

免疫胶体金技术优点：X蛋白定位于核仁

1.免疫荧光技术

2.免疫酶技术

3.免疫亲和技术

4.免疫胶体金技术

标记物

使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质总结：

免疫细胞化学方法有:直接法、间接法间接法中有:二抗、三抗或复合物

标记系统有:荧光素、酶、亲和素、胶体金观察方法有:荧光显微镜、普通光镜、电镜总结：

基本过程:固定（组织脱水、包埋、切片） ↓ 免疫细胞化学反应：抗原与抗体 ↓ 标记系统反应

免疫细胞化学方法（略）

简要过程:固定（组织脱水、包埋、切片）

通透（permeability)封闭(blocking)一抗孵育（primaryantibody)漂洗 二抗孵育（secondaryantibody) 漂洗显色

JMJD2B在结肠癌中的表达HRP标记抗体灵敏度：高特异性：好2.阳性程度有差异++：%+：%-：%3.核质分布有差异