蛋白偶联受体的探索之路记省略和briank kobilka

SCIENTIASINICA

42卷第12期1018~

G蛋白偶联受体的探索—记 尔化学奖得主RobertJ.Lefkowitz和BrianK.,第三医院血管医学,心血管分子生物学与调节肽,分子心血管学教育部,心血管受体研究北京市,100191*联系人E-mail:国家自然科学基金国际合作与交流项目(批准号:30910103902)和国家自然科学基金(批准号: :10.1360/052012-395化学奖颁给了RobertJ.LefkowitzBrianK.Kobilka,基于他们在G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptors,GPCRs)研究领域的杰出贡献.RobertJ.LefkowitzGPCRs研究的奠基人.他开创了利用放射配体研究受体功能的先河,证实了受体的存在,率先得到受体克隆,发现了G蛋白偶联受体激酶与-arrestins介导受体的减敏与内吞,并发现了-arrestins的信号转导功能BrianK.Kobilka多年来坚持不懈,GPCRs晶体学上的突破性方法,是揭示2肾上腺素受体晶体结构的第一人,GPCRs受体晶体结构领域的迅猛发展.尤其令人惊叹的是,他展示了2肾上腺素受体激活瞬间的晶体构象.GPCRs的科研经历及成果,希望读者能够有所

奖G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptors,GPCRs),亦被称为7次跨膜受体,是一类感受细胞外信号分子,激活细胞内信号传导通路并导致细胞反应的一类受体大.GPCRs的调控功能几乎涉及人体的所有生理过程,包括交感(肾上腺素受体,adren-ergicreceptors)与副交感胆碱能受体,acetylcholinereceptor)神经调节以控制血压心率等自主神经功能,视觉(如视紫红素,rhodopsin)、味觉、嗅觉、行为与

临超过50%的用药都是GPCRs受体的激动剂或拮抗剂,包括受体拮抗剂、抗组胺药和各种精神科用药 化学奖颁给了RobertJ.Lefkowitz和BrianK.就是基于他们在GPCRs研究领域的开创性发现尽管GPCRs种类和功能繁多,但它们信号转导的分子机理具有极大的相似性.GPCRs与激动剂配体结合后发生构象变化,G蛋白上结合的GDP交换成GTP,从而使G蛋白的亚基与,亚基分离,激活腺苷酸环化酶(adenylcyclase,AC)、磷脂酶C(phosph-英文英文格式:XiaoH,ZhangYY.ThediscoveryroadofG-protein-coupledreceptors:introductionoftheNobelPrizewinnersinChemistry2012,RobertJ.LefkowitzandBrianK.Kobilka.SCIENTIASINICAVitae,2012,42:1018–1024, :10.1360/052012-3954242卷12等:G化学奖得主等:G化学奖得主RobertJ.Lefkowitz和BrianK.olipaseC,PLC)或离子通道等,继而激活下游的信号通路,cAMP、甘油二酯(diacylglycerol,DG)、三磷酸肌醇(IP3)和钙信号等.这些都已经是写在教科书上的经典知识,2060年代末,当RobertJ.Lefkowitz开始GPCRs的研究之前,GPCRs尚只是一个抽象的概念[2],由于缺乏直接的,甚至被许多人怀疑是否存在受体[3,4].当时已经发现AC的存在,因此甚至有人认为“肾上腺素受体”RobertJ.Lefkowitz的涯始于1968年,在国立卫生(NH)做研究来履行他的兵役义务[6].经过14个月的无数次失败与努力后,他终于取得了初步成果,利用放射性碘标记的促肾上腺皮质激素(adrenocortioropchormone,ATH)证实了ATH与肾上腺皮质粗制膜上的ACH受体特异性结合并激活AC[7].从此,他开创了利用放射性配体研究受体功能的先河[8].直至今天,放射配体结合实验依然是检测受体亲和性、密度与功能的经典实验方.在NIH的科学研究工作结束后,Lefkowitz博士回到麻省总医院继续做心脏科医生,在那里他开始了肾上腺素受体的研究工作[9].1972年,他利用亲和色谱法(ffniychromaography)分离出心脏肾上腺素受体蛋白[10].1973年,Lefkowitz博士在Duke大学拥有了自己的.在那里,他与同事一起首次清楚地证实了肾上腺素受体和AC是截然不同的两个大分子[11].利用放射配体结合实验,他们发现受体结合及活性受GTP调节,因此提出了受体-GTP结合蛋白-AC三元复合模型(ternarycompexmode)[12].接下来,他们分离G蛋白以及AC,并在脂质囊泡中重建这一系统,决定性地证实了三元复合模型理论以及受体的功能特点[13,14].1986年,对Lefkowitz来说是意义非凡的一年.这一年,他和他的同事们成功克隆出肾上腺素受体(-adrenergicreceptor,AR),这是第一个被克隆的GPCR[15].与此同时,他们发现AR与视紫红质(rhodopsin)在结构上相似,G蛋白偶联发挥功能,从而提出了GPCRs可能是个大,结构上可能都是7次跨膜蛋白[16].这一里程碑式的发现开启了现代GPCR信号通路的研究.Lefkowitz本人都未曾想到,GPCRs800族,而且这个成员还在继续增加.肾上腺素受体的其他亚型随即也被克隆出来[17],利用点突

变[18]和嵌合受体(2-,2-adrenergicreceptor)的表达揭示了受体上特异性的配体结合区域与G蛋白偶联区域[19].根据AR的序列,他们又首次利用杂交技术得到了第一个“孤儿受体”(orphanGPCR,即未知配体与功能的GPCR)[20].一年后,他们又证实这个受体实际上是5HT1A受体,这也是第一个“去孤儿化”受体[21].直到今天,“孤儿受体”的研究依然在为药物在研究肾上腺素受体功能的过程中,Lefkowitz的研究小组发现了GPCR的减敏现象(desensitiza-tion)[22,23].也是在1986年,他们发现了一个新的激酶,可以磷酸化肾上腺素受体从而介导受体的减敏.这个激酶被称为肾上腺素受体激酶(-adrenergicreceptorkinase,ARK)[24].同时,研究视觉的科学家发现了视紫红质激酶(rhodopsinkinase),它参与了抑制视紫红质信号通路.Lefkowitz与他的同事克隆了视紫红质激酶,并发现它在结构上与ARK非常类似[25],从而联想到可能存在一个GPCRs激酶,现在称之为G(gprotein-coupledreceptorkinases, .随后 ,Lefkowitz研究组与其他研究组先后克隆出其他的GRK成员今天人们知道,这个包括个成员,称为GRK1~GRK7,调节了所有已知的7次跨膜受体.根据其结构、功能与组织表达特性,又分为GRK1,GRK2GRK4三个亚.其中GRK1亚包括GRK1(视紫红质激酶)和它们分别只表达在视网膜视杆细胞和视椎细胞.GRK2GRK2(ARK1GRK3(ARK2),它们是广泛表达的.GRK4亚包括GK4~GRK6,GRK4和肾脏组织中表达,GRK5GRK6是广泛表达的.它们都在结构上高度保守,具有3个结构域,包括一个中心催化区和两侧的两个调节区域[26].最近,Lefkowitz和他的同事们又利用蛋白GRKs,(“barcode”hyp-随着GRKs研究工作的深入,Lefkowitz研究组又发现了另一个调节受体功能的蛋白-arrestin.在纯化ARK的过程中,他们发现纯化的ARK虽然能磷酸化受体,但却失去了“减敏”受体的能力,因此推测可能存在另一个调节因子[28,29].当他们正为此困扰时,另一课题组了被称为“48Kprotein”或“Sgen”的视网膜蛋白可以与磷酸化的视紫红质结合从而干扰下游信号通路[30].LefkowitzARK的减敏能力[28,31].arrestin.随后,Lefkowitz研究组利用视网膜arrestin克隆,-arrestin1[32]和-arrestin2[33].现在知道,一共有4个arrestins,arrestin1和arrestin4只表达在视网膜,arrestin2(-arrestin1)和arrestin3(-arrestin2)则广泛表达.-arrestin1和-arrestin2通过阻断Gs蛋白激活,cAMP合成,参与GRK2的减敏作用.近年来,他们又发现-arrestins还可以通过招募磷酸二酯酶phosphodiesse(如PDE4D)到受体并降解第二信使,从而减敏受体信号通路[34].因此,-arrestinscAMPcAMP降解来介导受体减敏过程除了减敏受体,-arrestinsclathrin依赖的胞吞过程(clathrin-dependentendocytosis)[35他们还发现,介导受体内化的胞吞过程需要-arrestinsE3ubiquitinligaseMDM2泛素化,从而介导受体的降解[36].近年来,他们还发现-arrestins本身可以作为信号分子传导下游信号通路[37].-arrestins可以结合并激活c-Src,激活下游MAPkinases(ERK1/2,P38JNK3),还可以激活AKT,PI3kinase或的其他蛋白,并通过形成复杂的网路进行信号传导[38].近期的这些发现改变了人们对GPCRs信号通路的认识,-arrestin/GRK系统不仅可以减敏受体信号通路,其本身同时还可以介导下游信号通路,调节一系列的细胞生理功能,包括产生促细胞生存和抗凋亡的效应[37].这一概念了新的药物开发模式,即研发新的配体,只选择性地激活-arrestin依赖的G蛋白依赖的信号通路中的一条,而不激活另一条信号通路.根据现代药理学家的说法,这种配体被称为“biasedagonists”.另一方面,这一概念也了新的阻断剂的研究,即只阻断G蛋白依赖的信号通路,而不阻断-arrestin依赖的促生存抗凋亡的信号通路.“super-receptorblockers”.这一阻断剂有望替代现在临床常用的肾上腺素受体阻断剂(beta-blockers)和血管紧张素受体阻断剂(angiotensinreceptorblockersARBs)来发挥更特异的纵观Lefkowitz的研究,几乎囊括了GPCRs现代研究的每个重大发现,GPCRs

奠基人毫不为过.他的走出了很多研究GPCRs的优秀科学家,其中就包括此次化学奖的另一得主 BrianK.Kobilka.Kobilka加入Lefkowitz后的第一个课题就是克隆AR并确定其序列[15].当时他们手头只有一些不完整的受体蛋白序列,与Merk公司已经合作了2年都以失败告终.Kobilka加入后,也利用cDNA克隆的方法尝试,多次努力后均无功而返于是,Kobilka做出了一个大胆的决定,即建立一个组文库,AR序列片段相匹配的序列,从而得到完整的序列[15].要知道,这是1986年,而不是人类 组计划已经完成的今天.Kobilka的决定无疑是的,但他成功了,很快他们克隆出了AR并得到了完整的序列如前文所述,这是一个里程碑式的成果.KobilkaGPCRs的研究作为他毕生的追求.生活中的他是个谦逊、不善言辞甚至害怕社交的人,只有在谈到GPCRs时,整个人才变得生动起来,毫不掩饰他对GPCRs的热爱[39].Duke大学后,KobilkaStandford大学的教职,在那里他开始了GPCRs三维分子结构的研究.XGPCRs的三维结构,必须首先得到GPCRs晶体.这是一个让众多科学家望而却步的,因为GPCRs的几个特性让它极难形成结晶.首先,GPCRs是膜蛋白,需要将它从膜上完整地分离下来并结晶,而恰恰又是细胞膜才能维持它的立体形态.缺乏极性表面也让其比水溶性物质难结晶得多;其次,GPCRs在细胞中的表达量很低;最后,也是最重要的一点,GPCRs极不稳定,形态始终处于变化中,即便没有外界刺激,受体也是处于活化状态,传递着细胞外信号[40].出于对了解GPCRs分子结构的渴望,Dr.Kobilka在这条艰难地坚持了数十年.在此期间,视紫红质晶体第一个被纯化出来[41].GPCRs成员不同的是含量丰富且结构相对稳定,结构并不具有代表性.直到2007年,Dr.KobilkaGPCRs结构,并利用反向激动剂抑制其基础活性,最终得到了2AR结晶.受体第三内环参与G蛋白活化,并GRKs,arrestins和其他信号分子相互作用,是结构最不稳定的区域(unstructuredregions)[42].其中一个方法就是在受体第三内环结合上一个抗体(Fab5)以稳定受体2结构,促进晶体形成[42].而这一抗体并不影响受体亲和能力与构象[43];另一个方法则是将2肾上腺素受体的第三内环区用一个T4噬菌体溶菌酶(T4phagelysozyme,T4L)替代,从而稳定受体结构,促进结晶[44,45].这些研究揭示了AR的晶体结构与视紫红质存在显著不同,其跨膜区不是紧密地聚在一起,而是更为开放的结构,提2这是一个突破性的成果,但是Kobilka并没有止步,他又瞄向了下一个更具性的目标.已经得到了受体非活化状态下的晶体结构,那么受体被激活情况下的晶体结构又是如何呢?这个目标的实现无疑能让人们对受体功能的了解上升到更次.然而,受体更不稳定,G蛋白活化后也会立刻离开受体.2011年,Kobilka与他的合作者利用骆驼产生的纳米抗体(nanobody)Nb80,替代G蛋白并模拟其功能.他们将高浓度的激动剂结合的2AR重组在磷脂囊泡中,用来免疫美洲驼.由于骆驼科动物产生的抗体缺乏轻链,因此比一般的抗体要小得多.在此基础上,他们合成了纳米抗体,即保留完整的抗原结合区域,体积只有传Fab25%.他们发现,这种纳米抗体与2AR结合后,受体与激动剂的亲和性增加了上百倍,提示它可以模拟Gs功能.利用这个抗体,他们得到了与激动剂结合的处于活化状态的2AR纳米抗体复合物结晶[46].晶体结构表明,激活的受体第5,6跨膜区的胞内段向外位移,3,7位移[46].同年,T4溶菌酶(T4L)(Nb35)技术,Kobilka与他的合作者终于得到了2AR-Gs复合物结晶,

2AR-Gs复合物的晶体结构[47].这项研究向人们呈现了AR被激活并传导下游信号时的构象变化.评审委员会评价他们到了2AR被激活瞬间的构象,并盛赞该成果是一个分子学上的杰作,是数十年研究的结2纵观两位科学家的科研经历,不难发现他们的一个共性,那就是对科学信念的执着与百折不挠的精神.LefkowitzNIH14个月没有任何阳性结果时,他没有放弃;当Kobilka致力于GPCRs结构和功能研究多年没有突破性成果时,他没有放弃.奖评审评价他们的工作为“groundbreakingdiscoveries(开创性的发现)”[48],是因为他们做到了别人未能做到的事情,究其原因与他们的坚持不懈是分不开的.Lefkowitz在奖公布后的一次采访中曾说“像很多科学领域的研究一样,GPCRs研究工作是长期而费时并需要献身精神的,例如你需要花好几年分离这些受体,然后很多年取得受体克隆,Kobilka10~15年的时间才得到这些受体的晶体,这是非常的”[49].是的,这是常人难以,但是他们坚持了下来,并最终获得了2本文综述了RobertJ.Lefkowitz和BrianK.Kobilka两位奖得主的科研经历,希望读者能从中有所借鉴及思考.“Scienceis99percentfailure,andthat'sanoptimisticview”—LefkowitzDuke大学校长一次公开谈话中的一句话无疑是对科研工作的最好注释[50].科研工作中失败是很常见的,如何从失败中学习并寻找下一个突破口才是最关键的.而每一份成功与荣耀的背后,必然都是数不清的日夜辛劳、失败与坚持,并如此反复循环的结果.TheNobelPrizeinChemistry2012-PopularInformation.14Oct2012,http://LangleyJN.Onthereactionofcellsandofnerve-endingstocertainpoisons,chieflyasregardsthereactionofstriatedmuscletonicotineandtocurari.JPhysiol,1905,33:374–413DaleH.Modesofdrugaction.Generalintroductoryaddress.TransFaradaySoc,1943,39:319b–322b,: 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