LAMP技术和应用专题知识医学课件

LAMP技术和应用专题知识LAMP技术和应用专题知识第1页LAMP技术

环介导等温扩增法(loopmediatedisothermalamplification,LAMP),是一个在恒定温度下实现核酸指数级扩增技术已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫)LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方法对试验室基础设施、设备要求较少,逐步用于结核分枝杆菌诊疗判别中世界卫生组织于8月11日,在日内瓦公布了一份最新推荐书,推荐发展中国家基础医疗单位使用该方法,能够作为痰涂片检测方法替换方案LAMP技术和应用专题知识第2页县区级检测结核分枝杆菌环介导等温扩增多色巢氏荧光PCR法交叉引物发RNA等温扩增法等省、自治区检测结核分枝杆菌检测是否对利福平和异烟肼耐药地市级结核分枝杆菌及是否对利福平和异烟肼耐药基因芯片溶解曲线线性探针“十三五”计划要求逐步推广新诊疗技术LAMP技术和应用专题知识第3页LAMP技术原理对靶基因6个特异部位设定4种引物,利用含有链置换活性BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成,从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。LAMP技术和应用专题知识第4页LAMP法使用酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase扩增对象为双链DNA时,其中一条链解离同时进行链延长。LAMP法使用最适温度65℃聚合酶。2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第5页LAMP法引物设计2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第6页LAMP法原理2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第7页LAMP法原理2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第8页LAMP技术特点灵敏度高LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。特异性强通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。速度快恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省却温度循环，在30min～60min内即可完成反应过程。设备简单只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。产物检测便捷在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性判断LAMP反应；可与荧光物质结合。LAMP技术和应用专题知识第9页LAMP法和其她PCR法比较2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第10页LAMP法和其她PCR法比较2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第11页LAMP法所需试剂2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第12页LAMP技术介绍环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人员发明一个新型体外等温扩增特异核酸片段技术。该技术能够在等温条件下（约65℃）进行核酸扩增反应,克服了传统PCR反应需要经过反复热变性过程取得单链模板缺点,从而实现在恒温条件下进行连续快速核酸扩增,而且能够经过简易直观目测判读结果,相比传统PCR大大节省了时间和试验操作步骤。2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第13页LAMP法常规操作步骤2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第14页LAMP法检测方法琼脂糖凝胶电泳法由LAMP原理可知,LAMP反应最终扩增产物是茎环DNA组成混合物,即有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜结构。所以,LAMP扩增产物在2％琼脂糖凝胶糖上展现是经典梯状条带。（图A）肉眼观察法在LAMP反应过程中,能够经过产生副产物焦磷酸镁白色沉淀产生来肉眼直接判定扩增反应是否进行。（图B）经过荧光染料检测有时,经过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定误差,所以也可经过添加荧光染料,如溴化乙锭(EB)、SYBRGreenI等进行染色,来检测扩增是否发生。（图C）2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第15页2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第16页LAMP法在结核菌检测中应用靶标限定:结核分枝杆菌复合群gyrB基因作为结核分枝杆菌关键功效基因,在复合群进化过程中非常保守,LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。临床上感染人类是结核分枝杆菌复合群,包含结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。对检测对象正确限定能避免假阳性过高而增加诊疗成本,长远来说,更有利于避免耐药性产生。2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第17页LAMP法在结核菌检测中应用适宜检测对象

以临床上引发结核感染结核分枝杆菌复合群为检测对象,可避免假阳性过高。反应管预装反应体系

扩增及检测在全封闭反应管中进行,有效降低气溶胶污染;用户操作简便、降低操作误差。结果易读

产物和显色液直接显色即可肉眼判定结果。技术特点:2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第18页LAMP法在结核菌检测中应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果灵敏度＝89.54%阳性结果预期值＝98.13%特异性＝98.93%阴性结果预期值＝93.77%总符合率＝95.31%2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第19页LAMP法在结核菌检测中应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果阳性一致率=88.56%阴性一致率=93.06%总符合率=91.36%2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第20页WHO认为LAMP法检测结果优于痰涂片检测。在已经有肺结核症状检测者中进行对比,TB-LAMP法比痰涂片检测法多检出15%患者。对比WHO多年推荐其它快速检测法,假如把TB-LAMP法用于对痰涂片检测阴性患者复查,TB-LAMP法检出率要高40%。2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第21页LAMP法在结核菌检测中应用现有结核诊疗方法和环介导恒温扩增法比较2023/5/21LAMP技术和应用专题知识第22页痰标本目测法检测步骤100分钟

LAMP技术和应用专题知识第23页一、样品处理1、用2~3倍体积4%NaOH溶液消化痰液2、吸收1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中LAMP技术和应用专题知识第24页一、样品处理2、13000r/min离心10min,尽可能吸弃上清LAMP技术和应用专题知识第25页一、样品处理3、沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤LAMP技术和应用专题知识第26页一、样品处理4、13000r/min离心10min,尽可能吸弃上清5、反复步骤3、4一次LAMP技术和应用专题知识第27页一、样品处理6、向含沉淀物离心管分别加入100μLDNA提取液,混匀后沸水浴10minLAMP技术和应用专题知识第28页一、样品处理7、冷却至室温后,13000r/min离心﹥5min,上清即为核酸模板LAMP技术和应用专题知识第29页二、核酸扩增1、向反应管内按次序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2.5μL,注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反应管大腔内,盖紧管盖并做好标识,移至反应区LAMP技术和应用专题知识第30页二、核酸扩增2、置65℃恒温反应60minLAMP技术和应用专题知识第31页三、结果判定1、反应结束,将反应管倒置甩动2次,再正置甩动2次,使工作液与显色液充足混合LAMP技术和应用专题知识第32页三、结果判定2、在阴性对照反应管液体颜色为无色（或橙色）,阳性对照反应管液体颜色呈绿色条件下:若待检样本反应管中液体颜色呈绿色,则可汇报该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性;若待检样本反应管中液体颜色为无色（或橙色）,则可汇报该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性;若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符,则此次检测结果无效,应重新检测。LAMP技术和应用专题知识第33页（1）LAMP结果为阳性,涂片结果也为阳性。可做出患者疑似患有结核病诊疗,并开始抗结核诊疗,同时等候培养结果。（2）LAMP结果阳性,而涂片结果为阴性。依据临床症状判定是否开始抗结核诊疗,同时等候培养结果。这时可考虑增加一个或一个以上标本进行LAMP检测以确定。假如增加标本检测结果也为阳性,则患者可被初步诊疗为患有结核病,并等候培养结果。（3）LAMP结果为阴性,涂片结果为阳性。应考虑LAMP结果是否受痰标本中抑制物影响,并增加一个或一个以上标本检测。若增加标本检测结果仍不变,且排除抑制物原因,则患者可初步考虑为非结核分枝杆菌感染,进行深入确诊试验。（4）LAMP结果为阴性,涂片结果亦为阴性。依据临床症状判定是否开始抗结核诊疗,并等候培养结果。（5）随访患者LAMP结果阳性,不能作为随访患者疗效评价。LAMP检测结果临床应用LAMP技术和应用专题知识第34