细胞培养：第七章 个别细胞和组织的培养

第七章个别细胞和组织的培养

类型：正常细胞培养肿瘤细胞培养第一节正常细胞培养

正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。正常细胞难培养的原因：它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格.但只要一切条件适当仍有培养成功可能。

上皮组织由排列密集而规则的细胞和少量间质构成，细胞之间借粘着物和特殊连接结构相连。分布于人体或动物体的外表面和管、腔、囊的内表面，按照细胞的层次可分为单层上皮和复层上皮。

特征性生长状态：膜状生长（细胞紧密相连），细胞数量多时最为明显；不规则多角形，呈铺路石样；以及“拉网”现象（Netting）。

一、上皮细胞类培养

胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上皮组织。身体不同部位的上皮组织，因为所处的位置不同而有不同的功能，主要表现为保护、吸收、排泄和分泌等功能。培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。在体外培养时，上皮组织还部分保留体内生长时的特性。一方面上皮细胞常成群存在或紧密相连成单层膜，极少出现脱离细胞群而单独存在的细胞，表现为上皮细胞生长的群体依赖性。另一方面，上皮组织经一段时间的生长增殖，细胞数量增多，细胞相互接触连接成片后，细胞的生长受到抑制，培养细胞的数量不再增加，此现象为接触抑制。体外培养上皮组织的生长与增殖特性：同其他组织来源的细胞相比，上皮组织的细胞培养条件要求更高，常需生长在特殊的生长基质上，且极易失去在体内已有的分化特征，如细胞极性等。因此上皮细胞的体外培养条件和要求不仅保证上皮细胞在体外的生长和繁殖，而且应尽可能地恢复和诱导上皮细胞在体外培养状态下的分化。

生长基质的支持：体内的上皮组织的基底面一般均附着在基膜上，借此与结缔组织相连。一旦将上皮组织从体内环境转移到体外培养，上皮细胞只能依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓贴壁依赖性细胞。特殊的培养基：可用于上皮组织体外培养的培养基有M199、RPMI1640、DMEM和F12。其中M199、RPMI1640较为常用。由于许多上皮组织的体外培养都依赖于血清才能生长，所以在培养时一般都要在上述培养基中添加一定浓度血清。在培养基中尚需添加各种促细胞生长因子，以促进细胞的生长和增殖。但由于血清成分复杂，其中也含有一定量的有毒物和抑制物，所以人们在已知细胞培养所需促生长物质和促细胞贴附物质的基础上设计了无血清培养基，无血清培养基也有良好的促生长作用，但仍需完善和改进。

去除成纤维细胞体内的上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。在分离细胞培养时，由于取材时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混杂生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为细胞的污染源。在培养上皮细胞时，要特别注意去除和抑制成纤维细胞的生长。上皮细胞培养有三个难点：①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；②需求特殊培养基；③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。（一）表皮细胞培养

表皮属于一种角化的复层扁平上皮，由角质形成细胞和非角质形成细胞组成。角质形成细胞呈层排列，皮肤的干细胞位于角质形成细胞的基底层，具有活跃的增殖能力。真皮组织对表皮基底层细胞的分裂增殖具有直接的影响。①皮肤是表皮细胞培养来源，小儿包皮、早产流产儿皮肤组织最为理想。

②培养液：DMEM/F12(3:1，V/V)、胰岛素、转铁球蛋白、氢化可的松、促表皮生长因子(EGF)。

③采用胶原底物或NIH3T3为饲养层细胞，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。

④表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞。冷消化法（使表皮和真皮结合松散），胶原酶消化效果较好，对结缔组织有较强消化作用，对表皮细胞损伤小。

⑤排除成纤维细胞的处理，选用不含血小板生长因子的无血清培养基。

⑥亦可用全皮消化法或组织块培养法培养，但表皮细胞和成纤维细胞混合生长，难以纯化。表皮细胞培养的要点:表皮细胞培养程序：(1)取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5~1cm2小块；(2)EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。(3)冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜；(4)分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；(5)温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30~60分钟；(6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清.(8)培养：接种入碟皿中，CO2温箱培养。注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。（二）乳腺上皮细胞的培养

乳腺主要由腺上皮组成，培养成功时可获纯上皮细胞培养物，既可培养正常乳腺，也可利用乳腺癌组织。

1.选取脂肪少，腺体组织多的部位，尽可能剥除脂肪组织（易培养）。

2.培养正常乳腺组织宜用胶原酶消化法。

3.培养乳腺癌组织可用两种培养方法：①

直接培养法：适用于含纤维少的软组织，剪切成碎片→加培养液，吸管吹打，置3～5分钟→吸除上层非腺细胞成分→反复2～3次→无菌纱布滤过→调整好细胞团块浓度→移入细胞培养瓶中37℃培养。②

胶原酶消化法：适合于含纤维多的较硬癌组织。

4.上皮细胞生长在胶原上比其他底物上效果更好，且生长后的乳腺上皮细胞对塑料底物的贴附甚牢不易解离，不利于制成细胞悬液进行传代。在接种底物上铺以胶原层较好，既利于乳腺细胞生长，也易使细胞分离制成悬液进行传代。5.培养液：

RPMI1640+胎牛血清，补加胰岛素、氢化可的松有利于乳腺上皮细胞生长。

无血清培养基+EGFC（上皮细胞生长因子）、胰岛素、氢化可的松，猪促乳素和前列腺素均可。

实验材料：

1.

人哺乳期早期或断奶后乳汁。

2.

培养液：RPMI1640，15%FBS，10%人血清，50μg/ml霍乱毒素，0.5mg/ml氢化可的松，1mg/ml胰岛素。

3.

HuS（humanserum）：血库过期的血清，澳大利亚抗原阴性。5cmNunc塑料培养皿。

4.

不含Ca2+

和Mg2+

的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4。

乳汁正常乳腺上皮细胞培养

5.

培养用液：1mg/ml胰岛素，用6mmol/L盐酸配制；0.5mg/ml氢化可的松，用生理盐水配制；50μg/ml霍乱毒素，用生理盐水配制。

血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰酶和胰蛋白酶应在-20℃条件下保存。

6.

消化液（TEGPED）

：胰蛋白酶液：加入13mmol/LEGTA10ml，用PBSA配置。

7.

7mmol/LEDTA：4ml，用PBSA配置。

8.

0.2%胰蛋白酶：4ml，用HBSS配置。

9.

1%胰酶：2ml，用HBSS配置。

实验方法：

1.

于产后2～

7d收集乳汁。用无菌水擦洗乳房，将乳汁挤入无菌容器。将收集的乳汁混合后，用RPMI1640稀释，以利于离心。

2.

将稀释的乳汁离心（600～1000g，20min）后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应留有少量液体。用含有5%FBS的RPMI1640洗细胞2～

4次，直至上清不浑浊。

3.

用生长培养液混悬细胞，将50μl细胞悬液加入含6ml培养液的5cm培养皿中。在37℃，5%CO2

条件下培养细胞。

4.

3～

5d后换液，以后每周换液2次，6～

8d出现克隆。开始时，有巨噬细胞混杂生长，起饲养细胞的作用。克隆增多后巨噬细胞逐渐消失。

5.

传代培养。细胞长满底壁80%～

85%时，可传代。每个5cm培养皿1.5ml加入TEGPED，37℃孵育细胞5～

15min。然后，混悬细胞。

6.

离心（1000g，5min）后，用培养液混悬细胞，将细胞悬液稀释3倍。将细胞悬液接种到培养皿或培养瓶中，每3个培养皿或每1个培养瓶2ml。人乳腺上皮细胞（三）胃黏膜上皮细胞的培养

1.材料来源：胚胎胃黏膜、手术切除组织。

2.胶原底物：1%Ⅳ胶原蛋白或1%明胶涂布瓶壁。

3.消化液：Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶并用，DMEM配制，37℃消化80分钟。

4.含有特定成分的培养液：DMEM和F12按1:1混合，添加5%FBS、胰岛素、转铁蛋白、新生牛脑提取物等。

5.培养程序：(1)取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许；(2)清洗：用含庆大霉素(400μg/m1)和二性霉素(2μg/m1的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm大小；(3)消化：在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80分钟；(4)离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次；(5)接种：末次离心后加入含有1％~2％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。6.结果分析：细胞接种后一般在16小时内贴壁，细胞呈多角形，胞质透明，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。

7.胃黏膜上皮细胞的鉴定

①角蛋白免疫组化染色胃黏膜上皮细胞呈阳性反应。

②粘蛋白组化染色显示培养的胃黏膜上皮细胞主要为分泌黏液的细胞。

8.注意事项：①注意消化酶的选择和控制消化时间。②正常胃黏膜上皮细胞一般采用原代培养。③多加血清并不能提高促细胞生长作用，血清中TGF-β1有抑制上皮细胞生长的作用。（四）肝细胞培养

1.肝细胞具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养

2.初代培养（组织块培养效果好）

原代组织块培养：1mm3小组织块贴壁培养，效果较好。(易于贴壁，生长力好，一般次日可出现生长晕）

初代消化法培养：胰蛋白酶、胶原酶均可。

全肝可采用灌流法消化（能获得较纯的肝上皮细胞和较好的效果）。

3.易传代形成细胞系，常用培养基为RPMI1640。

肝脏灌流法：需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS洗除血污；(2)取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中。消化液在肝内停留20~30分后，在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。(3)待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI1640培养基培养(较其它培养基为好)，能获得较纯的肝上皮细胞和较好的效果。（五）内皮细胞培养

1．材料：人脐静脉，动物大动脉

2．常用方法为灌流消化法，消化用酶为胶原酶，消化时间通常3～10min，首次用胶原酶消化时，须做预试验，以找出最佳消化时间，防止消化不足细胞未脱落，也可避免因消化过度使内皮细胞底层成纤维细胞混入。

3.人脐静脉培养效果好，2～3天内皮细胞即可长成单层。细胞生长后，开始呈梭形，类成纤维细胞，连接成片后始显内皮细胞形态。一般传6～7代后即衰退，难以长期维持。兔血管内皮细胞可传10～30代。(1)取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于4℃中，但不宜超过12小时；无菌剪取长10~15厘米一段。

(2)先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的脐静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；

(3)用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1％的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3~10分钟；

(4)吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中；为获取更多细胞，可再注入温PBS冲洗2~3次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心；

(5)吸除上清，加1640培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时2~3天内细胞即可长成单层。血管内皮细胞(六)毛细血管内皮细胞培养

毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。近年毛细血管培养已获成功；利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织(如卵巢癌)等均可；1．材料：[肿瘤条件培养基制备](1)取C3H小鼠的S-180实体肉瘤组织；(2)胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培养液15m1(含10％小牛血清)种到培养瓶中培养；(3)在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10％小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获多量条件培养基；(4)4000转／分离心后，再通过0.22μm微孔滤膜滤过，-20℃冻存备用(临用前融解)。[凝胶底层制备](1)取60mmFalcon产培养皿，加1%Difco产明胶(用不合钙和镁的Hanks液配制)，铺盖瓶底，形成薄层；(2)置4℃过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。2．初代培养(1)取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks液洗除血污；(2)

消化：剥除被膜，分离出皮质，切成lmm3

小块，加0.5％胶原酶室温中消化1小时；每隔10分钟用吸管吹打悬液令消化充分；(3)过滤：通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110微米长的毛细血管小段；(4)离心：650rpm，4℃，离心7分钟后，弃掉上清胶原酶；(5)再离心：沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次；(6)

制细胞悬液：末次沉淀物仍用含10％小牛血清的Dulbecco改良Eag1e氏培养液重悬后，稍吹打；(7)接种：接种入铺有明胶底层的培养皿中，37℃培养；在培养头1~3小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮；(8)换液：吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液；每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1~4个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2~5天。3．毛细血管内皮细胞分离培养：(1)初代培养2~3天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起；(2)镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长(15~20分钟)；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；(3)用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；(4)剩余内皮细胞岛如小(5~20个细胞)而少时，生长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3等饲细胞；饲细胞接种量为4000细胞／cm2；(5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基；(6)接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘汰)，细胞增殖生长汇合后，按1:5传代。二、结缔组织

包括固有结缔组织、血液、淋巴液、软骨和骨，由细胞和细胞外基质构成。结缔组织的细胞主要有成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞以及软骨和骨细胞等。（一）成纤维细胞培养：

1.包括人在内的各种动物成纤维细胞都易培养，也往往是其他组织培养时的副产品，极易获得。

2.生物学性状稳定，很难发生转化，为二倍体细胞培养的主要对象人的二倍体细胞系主要为成纤维细胞。3.常用胰蛋白酶消化法。4.人胚肺、幼儿包皮和扁桃体组织。5.可采用真皮片进行培养，细胞以真皮片为中心向四周生长，呈梭型或不规则型。6.采用皮肤组织进行成纤维细胞培养时应尽量剥除皮下组织。小鼠成纤维细胞培养条件12.5~14.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好；最佳培养基为DMEM添加15%小牛血清；第3代细胞增殖最旺盛；室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以8~10min为宜。在培养ES细胞时，应选择第3~5代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。小鼠成纤维细胞；

细胞来源：swiss小鼠胚胎

【原创】人成纤维细胞HF

1.细胞种类：人成纤维细胞；2.培养天数：7d；3.放大倍数：10×10；

4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；

5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，贴壁生长

（二）巨噬细胞培养

Mφ属免疫细胞，具有多种生物学功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要实验工具。

1.来源于人胸水、腹水、血液和透析液等，实验多用小鼠腹腔渗出物，不加任何刺激物的情况下，一个小鼠腹腔可含有2～3×106个细胞，也无炎症反应，冲洗后即可用于培养。若欲获取多量Mφ，可于取材前向小鼠腹腔注射刺激物，通常取细胞前向动物腹腔内注射5～10ml4%硫代乙醇酸盐，缺点是很多刺激物能激活吞噬细胞并被其吞噬，进行培养后，刺激物不能很快被消化掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。全血可获得大量单核细胞，缺点是混有血小板及其他白细胞。

2.其他细胞（LC、NC、PC和成纤维细胞等）成分的排除，大多数单核巨噬细胞有极易附着玻璃表面的特性，可用附着分离法去除其他细胞成分，纯度可达95%。

3.巨噬细胞对胰蛋白酶和EDTA均不敏感，不易使之离壁，借此可与其他细胞相区别，也是淘汰其他细胞的方法。纯利多卡因37℃5分钟可使细胞分离。

4.正常Mφ能附着瓶壁，胞质延展，胞质有皱褶，胞核呈特有的肾形，细胞较多时可形成单层，有时细胞呈多角形并连接成网状。

5.

强烈的吞噬活动，如向培养中加入淀粉、乳胶粒和红细胞等，可见巨噬细胞能吞噬5个以上的颗粒。

6.直接从腹腔获取的巨噬细胞为静止性细胞，呈圆形，伪足不明显。经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬细胞，细胞多呈梭型，有较强的运动和吞噬能力。

7.巨噬细胞易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2~3周，多用作初代培养。

8.状态不良时，胞质常不延展，胞体变圆，不透明，或脱离瓶壁漂浮在培养液中和失去吞噬能力。

9.

巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A．1、RAW309、Cr.1等。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺激生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3～5秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧。使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml

Eagle培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生20～30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1～2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。各种巨噬细胞(三)成骨细胞的培养1.取材:胚胎或手术切除之骨组织。多选扁骨或长骨。2.胰蛋白酶或胶原酶。3.原代培养:(1)植块培养法成骨细胞具有迁移生长特点

(2)分离细胞培养法贴壁生长的成骨细胞为梭型或多边形,单层铺满培养瓶后可出现重叠生长。传代细胞形态与原代同。4.骨膜内层含有大量的骨原细胞，而成骨细胞是由骨原细胞增生分化而来，故亦可取骨膜进行培养。骨膜内成骨细胞含量丰富，培养的细胞可用于临床移植。5.成骨细胞的鉴定碱性磷酸酶染色时，成骨细胞的胞质及其周围基质呈阳性，但成纤维细胞染色呈阴性。也可用盖玻片培养，利用免疫学方法标记细胞内的骨钙素，以鉴定成骨细胞。6.培养的成骨细胞中常混杂有成纤维细胞，可利用差速黏附法除去成纤维细胞。成纤维细胞在5～10min内贴壁，而成骨细胞贴壁较慢。（四）软骨细胞的培养

软骨由软骨细胞和软骨基质组成。在软骨移植及软骨病发生机制的研究中，常需借助体外培养技术获得保持着分化特性的软骨细胞。

1.取材:胚胎或幼体的关节软骨及成人手术切除软骨。

2.0.2%的Ⅱ型胶原酶消化。

3.培养液可选择Ham12、DMEM和RPMI1640等，加20%～30%小牛血清。

4.前三代生长旺盛，细胞呈圆形或椭圆形，可分泌较丰富的细胞外基质。传代后，细胞变为多角形，变为梭形，6代后以梭形为主，增生几乎停止。

5.软骨细胞的鉴定根据软骨细胞产生的细胞外基质酸性糖胺多糖、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原来鉴定。细胞外基质含有酸性糖胺多糖时，甲苯胺蓝染色呈异染性；应用免疫抗体法染色观察细胞外基质是否含有Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原。D:原代软骨细胞培养7dE:第2代软骨细胞培养7d，呈长梭形，多角、呈明显的“铺路石”状，部分细胞集落已形成复层

三、肌肉组织

各种肌组织均可培养

（一）心肌细胞培养是最早利用的培养材料

1.一般认为正常成年心脏的心肌细胞不再分裂，因此心肌细胞的培养多采用动物或人的胚胎心脏以及刚出生动物的心脏，取心室肌。

2.可应用悬滴培养、组织块培养和消化培养法。

3.原代培养的心肌细胞呈纺锤形，并常混有成纤维细胞和内皮细胞；根据心肌细胞较其他细胞成分贴壁慢的特点，可采用胰蛋白酶消化后反复贴壁法，淘汰掉非心肌成分。

4.培养成功时，可于相差显微镜下，观察到横纹；培养1周后可见有节律性收缩现象，细胞可因收缩运动从支持物上脱落。成簇的心肌细胞呈放射状排列，可呈现同步化搏动。

5.心肌细胞的鉴定PAS染色显示心肌细胞中的糖原颗粒，以此鉴别心肌细胞与间质细胞；此外可应用HE染色观察心肌细胞的形态结构。

整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平

小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1～10d的乳鼠心脏，尤以出生1～4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。

[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。3、D-Hanks溶液（pH7.2～7.8）：KCl0.4g,KH2PO40.06g,NaCl8.00g,NaHCO30.35g,Na2HPO4•7H2O

0.09g,酚红

[实验步骤]

取生后1～4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清。再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置于二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。培养结果

在二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养24h后可见搏动的单层心肌细胞。乳鼠心肌细胞原代培养(二)骨骼肌细胞培养

①

胚胎或幼体的大腿肌组织最好。

②

胰蛋白酶消化，培养液中可加入1%胎汁以促进

分化。

③

胶原底物或明胶（Hanks液配的0.01％明胶）

可促进分化。

④细胞生长开始呈纺锤形，50～52h后出现多核

纤维（细胞融合），数日后融合停止，可见横

纹及收缩现象（融合后2～3天），有时可导致

细胞从底物脱离。

⑤

可进行传代培养成为有限细胞系，但易失去分

化现象；表现为肌细胞不发生融合，从而不能

形成多核肌纤维和出现收缩现象。

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的特点,且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。四、神经组织细胞培养

(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件,观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。

（一）神经元

为高度分化的细胞，在组织发生晚期已失去增殖能力，对生存条件要求较高，只有在适宜条件下，方可存活。

条件：1.接种在胶原支持物上

2.加入神经生长因子或胶质细胞因子才能

生存，并可能出现一定程度的分化现象，

如长出突起等。

3.但难以增殖，来源于胚胎的神经组织也

是如此。

神经组织主要由神经元和神经胶质细胞构成。

少突胶质细胞：产生髓磷质，有助于

神经元兴奋

星形胶质细胞：调节神经元兴奋时产

生的离子，为提供神

经元营养

小胶质细胞：产生促神经元发展和

完成功能活动的细胞

因子

(二)神经胶质细胞

较易培养，分少突、星形（易增殖）和小胶质三种。神经胶质细胞与神经元有共存关系。大鼠c6胶质细胞人脑星形胶质瘤细胞

1.原代培养（神经元和胶质):适用于研究神经元的功能活动和胶质细胞的关系，不传代时可培养3～6个月。神经元可出现一定的分化现象，但无增殖能力，最终衰退死亡；而神经胶质细胞尤以星形细胞能继续生存和分裂增殖。

2.

传代培养：神经胶质细胞是神经组织中比较易培养的成分，可传代形成二倍体细胞系。

特点：

（1）胶质细胞在培养中生长稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持良好的敏感性，能用Rous病毒和SV-40等诱发转化。

（2）贴壁过程较慢，细胞适应环境的时间较长，接种后初期，可能出现漂浮不贴壁现象。贴壁后短期也可能不见细胞分裂现象。一旦生长后，即能进入较旺盛的增殖状态。主要为星形胶质细胞形成连接不甚紧密的单层细胞。(三)培养方法人脑组织可用于神经胶质细胞培养，培养组织来自手术室无菌取脑髓灰质或白质均可用于培养。1．程序：(1)细胞悬液制备：获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入Hanks液中漂洗1~2次后，置于30~50倍的Hanks液中；脑组织比较柔软，反复吹打即可制备成细胞悬液。(2)排除脂肪成分和其它碎块：把悬液注入离心管中，在室温静置5~10分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复2~3次可获较多的细胞成分。(3)滤过、计数、接种：向末次沉降物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置5％C02温箱中培养。(4)传代：细胞生长汇合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做传代处理。2．生长特点：接种后初期，细胞可能出现飘浮不贴壁现象，贴壁后在短期内也可能不见细胞分裂现象；细胞适应环境过程较长，然而一旦生长后，即能进入较旺盛的增殖状态。生长开始常杂有巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞等，传二、三代后，这些成分即消失，逐渐形成均一的星形胶质细胞，一般形成连接不甚紧密的单层细胞。

新生大、小鼠背根神经节细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。

1．材料和方法

取新生一天的大鼠和小鼠。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤，然后剪取一段脊髓，背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上，在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨，暴露脊髓和神经节，用解剖镊分离出神经节。剥除神经节被膜，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃30min)分散后用种植培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液。接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中，每皿2ml细胞悬液。置标本于37℃10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养培养液培养。接种第3d,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖，作用48h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次，每次更换一半新鲜饲养培养液。

2.培养液成份种植培养液:80%Eagle,DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L);10%胎牛血清;10%马血清;NGF20ug/ml;谷氨酰胺100μg/ml脱氧核糖核酸酶I40μg/ml。

饲养培养液:95%Eagle;DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L)；5%马血清。NGF20ug/ml；神经营养素1ml/100ml.谷氨酰胺100μg/ml。

3．大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生大鼠背根节神经元接种后4h，大部分细胞可贴壁，呈圆形或椭圆形，直径8～14μm，胞体周围呈现一圈光晕。神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧，核仁明显，亦可见双核神经元。接种后24h，大部分贴壁细胞开始长出突起。其中多数为具有多个突起的多极神经元，突起细长，并可观察到突起末端的生长锥。除单个散布的神经元外，还常见到几个或多个神经元聚集在一起，它们向四周发出树枝状的神经突起。

培养2