灵芝多糖类成分

灵芝研究资讯网-灵芝-灵芝抱子粉灵芝多糖类（Polysaccharides）成分作者：灵芝发布于：2014-8-710:46分类：简介多糖类（Polysaccharides）成分多糖类是灵芝属的重要生物活性物质之一。药理研究表明：从不同灵芝种类中分离出的多糖均具有抗肿瘤作用、免疫调节作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用及抗衰老作用等，是当前一个很热门的研究课题。全世界灵芝属种类很多，就其多糖类研究主要以灵芝（赤芝、紫芝）研究居多，树舌、松杉灵芝（松杉树芝）虽有研究，相对较少，以日本、中国（台湾）、印度尼西亚、韩国、新加坡等研究较多，发展不平衡。总的来说，多糖研究的广度、深度不如三萜类化合物。灵芝多糖的药理活性与单糖连接方式、位置有关，通常单糖以1-3、1-6糖苷键连接的多糖具有药理活性，而纯1-4糖苷键连接的则不显示活性。多糖的药理活性，还与其组成的立体构型有关，若螺旋状结构破坏，其药理活性则明显降低。单糖之间的苷键，大多为1-3、1-4、1-6数种，多数为6-构型结构，少数为a-构型结构。在多数6-构型多糖分子中有分支部分，灵芝多糖含有15%-30%的肽，多糖链分枝密度高或含有一定量肽成分，其生理活性也较强。因此，多糖的构型与药理活性关系十分密切。利用研究多糖，首先应采用不同提取方法提纯，加以深入研究，才能比较透彻地了解多糖生物活性的本质。组成灵芝多糖的单糖类型以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖为主，还有少量岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、海藻糖等，少数多糖由单一葡萄糖组成。由于多糖的结构复杂，不同种类的灵芝菌，不能简单地用某种方法就可确定，必须采用多种方法、多种手段配合使用，将全部有关信息进行综合分析，才能较准确测定获得它的初级结构（一级结构），而它们的高级结构的研究就相对困难，就目前分离技术和研究手段的限制，对多糖类的研究，还不像三萜酸一样研究得透彻，这也说明为什么多糖研究深度和广度不够的原因。一、灵芝中的多糖1971年SasakiT等［58］从树舌子实体中分离出抗S-180肉瘤的活性多糖G-D、G-F、G-Z。经化学研究表明，该多糖中G-Z为6-（1-3）（1-4）连接的葡聚糖，并有微量木糖存在。1981年东京药学院MiyazakiT等［60］从灵芝子实体（fruitbodyofGanodermalucidum）分离出水溶性多糖GL-1，分子量为40000，GL-1由葡萄糖、木糖及阿拉伯糖组成，其分子比为18.8:1.5:1.4，主要成分为阿拉伯葡聚糖（arabinoyloglucan）侧链含a及6（1-4）D-毗喃葡萄糖基，6（1-6）及6（1-3）连接，阿拉伯糖为非还原性末端残基，木糖可能作为侧链的部分存在°GL-1对S-180肉瘤有强烈的抑制作用（当ip注射20mg-kg-1-10d），其抑制率为95.6%-98.5%，温和酸水解及a-淀粉酶处理，GL-1对抗肿瘤则没有效果。结果表明：GL-1抗肿瘤的重要结构为侧链葡聚糖核心含有6-（1-3）及6-（1-4）及6-（1-6）连接。1982年MiyazakiT等［59］以稀碱液（0.1MNaOH）从灵芝中提取分离出抗S-180肉瘤活性的水溶性多糖，分子量38000，经酸水解鉴定，该多糖含有L-岩藻糖、D-木糖和D-甘露糖，其分子比为1:1:1,经过碘酸氧化、Smith降解、部分酸水解、甲基化反应及气质（GC-MS）联用，证明其结构为：-4）-D-甘露糖（1-4）-D-甘露糖（1-4）-D-甘露糖（1-333TTT111D-木糖D-木糖D-木糖444TTTL-岩藻糖L-岩藻糖L-岩藻糖1983年UkaiS等［77］从日本产紫芝（Ganodermajaponicum）中分离出甘露多糖（Mannan）及水溶性葡聚糖（glucans）对S-180肉瘤显示抗肿瘤活性。年HikinoH等［61］从日本Kanagawa产的灵芝（GanodermalucidumKarst）的生药中分离出葡聚糖肽（peptidoglycans），灵芝葡聚糖A及B。临床观察有降血糖的活性。年TomodaK等［63］从灵芝（Ganodermalucidum（reishi）Kasten）子实体分离出降血糖成分，即灵芝葡聚糖B和口研究表明葡聚糖肽（peptidoglycans），分子量分别为7400及5800。灵芝葡聚糖B的侧链含D-毗喃葡萄糖基p（1-3）（1-6）苷键连接。灵芝葡聚糖C（ganoderanC）含毗喃葡萄糖基p（1—3）（1—6）及D-毗喃半乳糖基a-（1—6）苷键。1986年韩国汉城大学ShinHW等［62］从灵芝鹿角状抱子及菌盖（Ganodermalucidumpileus）鹿角状（horn-shapedcarpospore）进行分析，从其子实体分离出蛋白质多糖，经热水提取，丙酮沉淀及透析纯化得到多糖部分（51%）及蛋白质部分（5%），当ip50mg-kg-1小鼠上，可增强腹膜渗出物细胞（巨噬细胞）多形核蛋白细胞的积累，表明该糖蛋白具有免疫潜在活性。1997年HitoshiT等［64］从灵芝中提取4种多糖，腹腔注射对小鼠肉瘤S-180的抑制率达83.9%，半数动物肿瘤完全消退，该灵芝的抗肿瘤活性成分，似为含少量蛋白质的多糖。1992年北京医科大学药学院何云庆等［65］研究了灵芝子实体免疫多糖。从中分离出4种成分，其中1种具有（1—6）及（1—3）连接的葡萄糖多聚体。另1种为p（1—6）（1—3）连接的阿拉伯糖及半乳糖的多聚体。1993年KimB等［66］从朝鲜产灵芝（Ganodermalucidum）培养的菌丝体热水提取物中，发现与蛋白质结合的多糖Fr1-V，静脉注射ICR鼠，剂量为20mg-kg-1/d（V），对S-180肉瘤，抑制率为64.2%-75.8%，并对抗肿瘤化合物测定了免疫活性。它含有68.6%的多糖，系由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖及51%蛋白质（17种氨基酸组成，分子量为5.8x104道尔顿，命名为灵芝多糖（lucidan）。1993年林志彬和雷林生［67］［29］发现，每日给小鼠腹腔注射灵芝多糖GL-B（25-100mg-kg-1）4天。可明显增强小鼠脾细胞对LPS刺激的增殖反应。当剂量为100mg-kg-1时，脾细胞增殖反应较对照组增加84.8%。结果表明，GL-B可增强B淋巴细胞对LPS刺激的敏感性。1991年Ma等［29］报告灵芝多糖BN3A、BN3B和BN3C（0.05-1四・ml-1）均可显著增加C57BI/6j小鼠脾细胞在ConA存在条件下的IL-2产生，并可部分地拮抗环抱霉素A和氢化可的松对小鼠脾细胞产生IL-2的抑制作用。1994年何云庆等［68］从人工栽培的灵芝（赤芝）（Ganodermalucidum（Leyss.Fr）Karst）子实体热水提取物中分离出2种葡聚糖肽GLSP1、GLSP2,凝胶层析及高效液相证明其为单一的多糖均一体，测得分子量分别为12800及14100，完全水解、过碘酸氧化、Smith降解、光谱分析及甲基化分析表明：GLSP1为含有p（1—3）（1—6）及（1—4）苷键的葡聚糖肽，肽的含量占26.6%；GLSP2为含有p（1—6）及（1—4）苷键的葡聚糖肽，两类苷键糖基组成比例1：1,并有分枝，肽的含量占12.3%，碱性P-消去反应证明，2种葡聚糖肽的糖基与肽键的丝氨酸与苏氨酸以O-糖苷键相连接。1989年Hikino等［69］从灵芝子实体中分离出蛋白质的异多糖FA-1b,FIII-3a，共15种，其中，除FII-1无降血糖作用，FIII-1b降血糖作用较弱外，对正常小鼠均有明显降糖作用。灵芝多糖B（ganoderanB）能提高正常小鼠和糖负荷小鼠血浆胰岛素水平，灵芝多糖B可明显促进肝脏葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸和糖原合成酶活性，降低肝脏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。1989年何云庆等［70］从赤芝（灵芝）子实体分离出一种具有促进核酸蛋白合成代谢作用、改善造血功能的多糖BN3C（polysaccharideBN3C），从中分离出4种多糖均一体，经用现代研究方法确认，BN3C为葡聚糖，由葡萄糖、阿拉伯糖的肽多糖（peptidopolysaccharide）组成，葡萄糖与阿拉伯糖的摩尔数比为4：1,肽的含量为5.4%，由胱氨酸（cystine）、亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、Y-氨基丁酸（Y-aminobutyricacid）及微量精氨酸、赖氨酸（Lysine）、蛋氨酸、组氨酸（histidine）所组成。1989年HikinoH,MizunoT等［71］从灵芝子实体提取分离出蛋白质的异多糖FA-1b-F111-3a，共15种，其中F11-1无降血糖作用，F111-1b降血糖作用较弱外，对正常小鼠均有明显降血糖作用。肽多糖灵芝多糖B（ganoderanB）能提高正常小鼠和糖负荷小鼠血浆胰岛素水平，灵芝多糖B可明显促进肝脏葡萄糖激酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸和糖原合成酶活性，降低肝脏-6-磷酸氢酶活性。1995年Ma及Lin［73］发现，在给小鼠腹腔接种S-180细胞前预防给药或接种后治疗给药，灵芝多糖肽50mg・kg-1、100mg-kg-1和200mg・kg-1连续灌胃7-9日，可显著延长小鼠的存活时间，同样剂量的灵芝多糖肽还可抑制小鼠皮下接种的S-180生长，抑制率分别为21.7%、38.5%和35.5%，给荷Lewis肺癌小鼠连续灌胃灵芝多糖肽50mg-kg-1，共9日，也可显著地抑制Lewis肺癌生长，抑制率为55.5%。1996年KweonMH等［78］从朝鲜产灵芝（G.lucidum）热水提取物分得抗凝固多糖蛋白。2002年倪江洪等对灵芝抱子破壁前后多糖提取率进行了比较，结果如下：表5-11灵芝抱子破壁前后多糖提取率供试品提取率（％）未破壁1.13机械破壁1.16酶法破壁2.14据文献记载［81］，用不同材料如木枹栋、青岗栋和锯末栽培的灵芝子实体，其多糖的抗肿瘤活性基本相同，各种培养料上生长的灵芝子实体，开伞前子实体中多糖的抗肿瘤活性均较低（抑制率仅为22%-33%），而开伞后，成熟期和成熟后期的子实体中多糖的抗肿瘤活性均较高（抑制率达83%-99%），不同产地的灵芝中多糖含量不同。北京医科大学药学院李晓晖等的研究结果见表5-12。表5-12不同产地、外形的灵芝中多糖含量［81］供试品名称外形部位多糖含量（％）泰山灵芝鹿角状子实体菌盖1.14泰山灵芝鹿角状子实体菌盖1.03泰山灵芝云头状子实体1.58泰山灵芝云头状子实体1.34北京灵芝鹿角状子实体1.61北京灵芝云头状子实体0.90上述结果表明，不同产地的同种灵芝由于其人工栽培条件的不同，会导致多糖含量的差异。鹿角状灵芝中的多糖含量不一定低于云头状灵芝中的多糖含量。多糖的生物活性既与各种单糖连接方式有关，也与糖的组成、糖苷（1-3）、（1-4）及（1-6）连接，有无侧链、构型及构象等有关，还与灵芝的种类，生态条件，提取方法等息息相关。因此，探讨灵芝多糖结构、构型与活性之间的关系很有必要。

表5-13部分灵芝多糖的化学结构与分子量[29]名称化学结构分子量来源灵芝多糖A(ganoderanA)杂多糖肽(Rha:Gal:Glc=0.4：1.0：0.7)2.3X104G.lucidum灵芝灵芝多糖B(ganoderanB)酸性杂多糖肽(Man:Glc=0.05:1.0)(GlcA:GalA=0.7:1.0)7.4X104G.lucidum灵芝灵芝多糖B8(1—3)(1—6)葡聚糖肽7.4X103G.lucidum灵芝多糖C8(1—3)(1—4)半乳葡聚糖肽5.8X103G.lucidumBNB8(1—3)(1—6)葡聚糖3.4X104G.lucidum云头状3 1BNB8(1—6)(1—3)阿拉伯半乳聚糖4.0X104G.lucidum云头状BNC8(1—6)(1—3)葡聚糖1.6X104G.lucidum云头状BNC8(1—6)(1—3)阿拉伯葡聚糖肽2.5X104G.lucidum云头状F-1-1al"8(1—3)为主链(1一6)为支链的葡聚糖1.01X105G.applanatum树舌F-1-1a2"8(1—3)为主链(1一6)为支链的葡聚糖3.02X105G.applanatum树舌GLA48(1—3)(1—6)(1—4)葡萄糖为主的杂多糖(Glc:Xyl=4:1)1.30X104G.lucidum鹿角状GLA78(1—3)(1—6)(1—4)葡萄糖为主的杂多糖(Glc:Ara:Xyl:Gal=46:3:2:1)1.2X104G.lucidum鹿角状GLSP28(1—3)(1—6)(1—4)葡聚糖肽1.28X104G.lucidum鹿角状GLSP8(1—6)(1—4)葡聚糖肽1.41X104G.lucidum鹿角状GLB一8(1—4)(1一6)葡聚糖7.1X103G.lucidum鹿角状GLB38(1一4)(1一6)杂多糖(Man:Glc=1.0:1.3)7.7X103G.lucidum鹿角状GLB48(1一4)杂多糖(Ara:Xyl:Glc:Gal=1.9:1.2:0.4:3.6:1.0)9.0X103G.lucidum鹿角状GLB8(1—4)杂多糖8.8X103G.lucidum鹿角状GLB78(1—4)(1一6)杂多糖(Ara:Xyl:Man:Glc:Gal=0.3:0.2:0.6:2.6:1.0)9.0X103G.lucidum鹿角状GLB98(1—4)半乳葡聚糖(Gal:Glc=1.0:1.7)9.3X103G.lucidum鹿角状名称化学结构分子量来源GLB108(1—4)为主及少量8(1—6)的葡聚糖6.8X103G.lucidum鹿角状GLC 1 8(1—4)为主及少量8(1—6)杂多糖5.7X103G.lucidum鹿角状肽(Rha：Ara:Xyl:Man:Glc=0.8:0.5：0.4：1.2：4.5：1.0)GLC28（1—4）为主及少量8（1—6）葡聚糖含乙酰基6.0X103G.lucidum鹿角状TGLP-28（1—3）（1—4）甘露葡聚糖肽20.9X104G.lucidum泰山赤灵芝TGLP-38(1—3)(1—4)葡聚糖肽4.5X104G.lucidum泰山赤灵芝TGLP-68(1—3)(1—4)葡聚糖肽3.2X104G.lucidum泰山赤灵芝TGLP-78（1—3）（1—4）（1一6）半乳聚糖肽10.0X104G.lucidum泰山赤灵芝1997年张能荣等［28］测定灵芝抱子多糖和寡糖，其中二糖、三糖、四糖分别为194、167和250mg（100g）-1。二、松杉灵芝中的多糖1993年长春中医学院ZhangJE等［72］从松杉树芝（Ganodermatsugae）分离出中间宿主菌丝体的水溶部分中，分得16个部分，获得3种葡聚糖蛋白质多糖（glucan-proteinpolysaccharide）的复合物，对小鼠Sarcoma180有抗肿瘤活性，它含有25%-8%蛋白质，分子量为10000，另含有9.3%蛋白质的葡聚糖蛋白质，带有杂糖链的甘露糖（1）及木糖（11）的葡聚糖蛋白质复合物，分子量为16000，主要成分为阿拉伯糖1,11及半乳糖。1993年长春中医学院中药系WangGY等［74］从中国产松杉灵芝（G.tsugae）的子实体中分离出抗肿瘤的活性多糖类。从7种水溶及15种水不溶部分中分离出含有与甘露糖及岩藻糖结合的半乳葡聚糖的蛋白质（protein-containingglucogalactans），分别是Flo-a,FA-1,FII-1,FIII-2及FIII-2a,-b,-c，Flo-a，以及FA-1。F11为低蛋白质含量的葡聚糖（1-3）书-D-glucan）。水不溶部分FIII-2a,-b,-c含有（1-3）-6-葡聚糖蛋白质，显示有明显的抗肿瘤活性。1993年东北师范大学LiangZY等［75］从长白山松杉灵芝中分离出水溶性多糖GF3,侧链是（1-）连接半乳糖（linkedgalactose）（1-3）及（1-4）连接的葡萄糖残基，侧链与主链-0-3-葡萄糖及半乳糖残基连接，支点（branchedpoint）比例占主链的50%，支链比例（branchingrate）在分子中占57.9%，凝胶电泳测得分子量为128800，GF3含有（1-6）连接的主链半乳糖及（1-6）连接的葡萄糖残基。1993年长春中医学院ZhangJie等［72］从松杉灵芝（松杉树芝）的菌丝体水溶部分，采用DEAE-纤维素（Cl-）、离子交换层析、ToypearlHW-65F凝胶层析及ConAF-FormylToypearl650亲和层分得16个部分（多糖）。1993年梁忠岩（东北师范大学生物系）等［75］从松杉灵芝（GanodermatsugaeMerr）（松杉树芝）子实体热水提取物经冻融及乙醇分级，分离纯化GF3级分，其玻璃纤维电泳为单一带，交联琼脂凝胶CL-4B柱层析为单一窄分布峰，其MW为1288万。GF3经旧、GC-MS、13C-NMR，高碘酸盐氧化、Smith降解、甲基化及其产物之GC、GC-MS分析，部分水解及其产物分析等，确定GF3基本结构为1-6连接之葡萄糖和1-6连接半乳糖构成主干，侧链由非还原端半乳糖和1-3连接之葡萄糖和1-4连接的葡萄糖构成，侧链连接在主链葡萄糖及半乳糖基的O-3位上，主链中葡萄糖及半乳糖的分支点率约为50%，分子中分支率为57.9%。（注：长白山松杉树芝的子实体及粗多糖为长春中医学院中药系提供）。1994年梁忠岩等［76］从松杉灵芝（GanodermatsugaeMurr.）子实体和液体发酵菌丝体中分离出水溶性多糖。1983年日本岐阜药学院UkaiS等［77］从日本产紫芝（Ganodermajaponicum）中分离出水不溶性葡聚糖（glucan），其主链由（1-3）连接的D-葡萄糖残基，侧链为单一的葡萄糖基单元通过（1-6）连接到主链。水不溶葡聚糖系从碱溶液分到。对小鼠腹腔注射Sarcoma180显示抗肿瘤活性。1990年庄名扬［79］从拱状灵芝（Ganodermafornicotum）中分出拱状灵芝葡聚糖，为多枝结构由P（1—6）（1—2）-D-葡萄糖组成。三、灵芝多糖的提取分离及结构鉴定1、 灵芝多糖的提取分离灵芝属中灵芝多糖是由一种或多种单糖，并由一个糖的还原性端基C1与另一糖C2、C3、C4或C6的羟基彼此脱水缩合的大分子化合物，结构复杂，不具有原来单糖的性质，成为无味的碳水化合物。灵芝多糖，能溶于水（温、热），不溶于或难溶于醇（乙醇、甲醇）、醚、丙酮等有机溶剂。少数能溶于二甲亚砜等溶剂。可溶于稀碱、稀酸溶液。因此，利用多糖的溶解性质，通常实验室均采用热水提取，即以水为溶剂于90-100T加热提取，将提取液浓缩后，加入数倍量乙醇使多糖沉淀析出，所得多糖，因内含蛋白质杂质，实验室常用Sevag法（①氯仿+正丁醇5:1V/V；或②氯仿1/5+异戊醇1/15V/V）除去游离蛋白质。其法是将氯仿+正丁醇（5/1V/V）混合液加入粗多糖水溶液中，多次振摇，使蛋白质变性，在乳化层中除去，反覆多次操作，除尽游离蛋白质，并用透析法除去小分子杂质，再加乙醇使多糖沉淀为灵芝总多糖（粗多糖）。何云庆、李荣芷等［29］介绍，在提取时，先用乙醇或甲醇回流提取，残渣除尽醇以后再用水提取，也有用二氯甲烷处理后，再进行提取，但要注意防止降解，稀碱提取液应迅速中和、透析，也可用酸或乙醇沉淀得碱溶性多糖。2、 多糖的纯化和纯度测定除去游离蛋白质及小分子杂质后得到的灵芝总多糖，它是由多个均一体组成，分子量分布范围较宽，不适宜进行化学测定和分析，需进一步分离纯化得到分子量范围较窄的单一组成。灵芝多糖常用的分离纯化方法有：分部（分步）划分、沉淀法、凝胶柱层析法、纤维素阴离子交换柱层析法、季铵盐沉淀法等。1） 分部（分级）沉淀法依据多糖分子量的大小，在不同浓度的醇（乙醇或甲醇）中溶解度不同，依次沉淀析出。何云庆、李荣芷［29］研究赤芝多糖（灵芝多糖）的有效部位时，将水提浓缩液加入乙醇成30%浓度析出沉淀，除蛋白质后得A部分；再加乙醇使成60%浓度析出沉淀，除蛋白质后得多糖B部分；再加乙醇浓度达90%析出部分，再除去蛋白质后得多糖C部分。将多糖A、B、C分别进行筛选，找到活性最好的部位进行深入研究。2） 凝胶层析法葡聚糖凝胶（sephadex），它是一种分子筛，由于含有大量的羟基，故具有亲水特性，能在水解质中溶胀成凝胶粒子。采用凝胶为固定相，使多糖按分子大小不同而获得分离。常用的凝胶为葡聚糖凝胶（sephadexG-100,G-75,G-50）及琼脂糖凝胶（sepharose）洗脱剂以低浓度盐溶液为宜，如0.1MNaCl（0.1%）。应用琼脂糖凝胶（sepharose,Bio-Gel）柱层析，常用Sepharose4B及6B，实际应用时可以根据要分离纯化的多糖分子量大小不同，选择不同型号的凝胶，也可应用凝胶柱层析除去小分子杂质（脱盐）等。除上述凝胶外，还有（CM-sephadex）-羧甲基交联葡聚糖凝胶、磺丙基交联葡聚糖凝胶（sp-sephadex）等。3） 纤维素阴离子交换柱层析法常用的阴离子交换纤维素为二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素），由于分子中引入阴离子，它是一种弱碱性阴离子交换剂，具有亲水性，可以将酸性多糖、中性多糖分离。一般分子量较大、酸性强的多糖由于吸附力较强，可以与其它类型多糖分开。实际应用中，可将DEAE纤维素予以处理成硼酸型，将中性多糖上柱后，依硼砂溶液浓度递增的条件逐个洗脱，可以分离多个结构不同的中性多糖。目前这个方法在多糖分离中应用很普遍，分离效果好，且能使带色素的总糖的色素部分留在柱上除去，得到纯的均一体。除DEAE纤维素外，尚有将与葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶结合的吸附剂，DEAE-sephadex，DEAE-sepharose，既有阴离子交换作用，又有分子筛作用。4）季铵盐沉淀法1971年SasakiT等在分离树舌（Ganodermaapplanatum（pers.Exwallr.）pat）的多糖时，采用CTA-OH（氢氧化十六烷基三甲胺），将多糖沉淀析出，然后再以乙醇分部沉淀，得G-F、G-D、G-Z部分进行抗肿瘤活性筛选。季铵盐除CTA-OH外，还有CTAB（十六烷基三甲胺漠化物及CPC十六烷基毗啶）。它们能使酸性多糖形成不溶性复合物，可与酸性多糖、中性多糖分开。灵芝多糖经纯化后得到的单一组分，它们只是相似链长的有较窄分子量分布范围的均一体，它的纯度测定与灵芝中三萜酸不同。测定多糖纯质的方法，有凝胶过滤法（Gelfiltration）、超速离心法、旋光测定法、凝胶电泳法、高压电泳及高效液相层析法等。3、 灵芝多糖的分子量测定凝胶过滤是根据灵芝中不同分子量的多糖在一定型号的凝胶柱上与洗脱体积成定量关系，常用的为sephadex，型号G100，用已知分子量的葡聚糖系列上柱，求出洗脱体积与分子量标准曲线，测定未知灵芝多糖的洗脱体积，求出它的分子量值。高效液相色谱法测定分子量，其原理是以双蒸水为洗脱剂，以标准分子量葡聚糖（MW）分别测得保留时间（RT），再将未知样品在标定的条件下进行分析，测定保留时间，计算实验结果。4、 灵芝多糖的结构测定目前关于灵芝属中分出的灵芝多糖结构，主要为平面结构（初级结构），初级结构的测定可以阐明组成多糖的各种单糖的类型及分子（摩尔）比；每个单糖残基的D型或L-型，毗喃或呋喃环形式；各单糖残基连接的次序，连接方式；端基碳（异头碳）的苷键a-或p型，多糖有主链及侧链以及糖链与非糖部分（肽链）的连接点。单糖的鉴定常用纸层析，气相层析等。关于多糖结构鉴定有光谱分析法、核磁共振波谱法（氢谱、碳谱）、质谱、气相色谱分析法等。糖链结构的化学分析：酸水解，选择性酸水解、甲醇解、乙酰解、过碘酸氧化、Smith降解、经典甲基化、箱森法甲基化、p-消去反应及酶解等。文献介绍方法很多，读者可以参见吴东儒主编［80］，《糖类的生物化学》一书中有关多糖结构的测定。5、 光谱分析1） 红外光谱（IR）：灵芝多糖系多个碳水化合物聚合而成的大分子化合物，主要存在有羟基、氨基、酰胺基及碳氢等功能团，这些特征吸收峰出现，就能很快知道该多糖的主要特征，确定该多糖是a-构型，还是p-构型。例如kazwos等从灵芝中分离出一种水溶性多糖GL-A，红外光谱测定显示920cm-1,1430cm-1，1610cm-1处有特征峰，推测该多糖属p-苷键，且含羧酸基团。在毗喃糖苷键（glucopyranoside）的构型中如果a-型的端基差向异构体（terminalepimer），C-H取平伏键，在844±8cm-1处有一吸收峰；P-构型差向异构体（p-configurationepimer）C-H为直立键，则在891±7cm-1处有吸收峰。在杂多糖或有甘露聚糖形式存在时，则在875cm-1处有吸收峰，当有岩藻糖（fucose）或鼠李糖（rhamnose）等糖时，在967±6cm-1处有吸收峰，半乳毗喃糖残基则在875cm-1处有吸收峰。多糖羟基在3700cm-1-3100cm-1吸收峰特别强。根据红外光谱吸收峰的情况，就可以初步判断多糖性质、构型，并借助其它鉴定手段加以确证。2） 1H和13C核磁共振波谱1H-NMR主要解决多糖结构苷键的构型，a-构型还是p-构型，多糖中氢质子信号在04.0〜5.50ppm范围。a-型毗喃糖基C1位上质子〉5.0ppm，而p-型＜5.0ppm。应用1H-NMR仪时，磁场强度大于300兆，如500，650兆时，测出氢质子信号清晰，精确。特别是对复杂分子多糖，仪器的灵敏度和分辩率十分重要，其对推断结构十分有用。13CNMR的化学位移较1H-NMR为广，其化学位移可达200ppm。既可以确定各种碳的位置，又可区分单糖的构型和构象，利用峰的相对高度定量测定多糖中不同残基的相对比例，多糖中残基取代位置和分枝点。1993年梁忠岩等［75］从长白山松杉灵芝（木灵芝，松杉树芝）（GanodermatsugaeMurr.）子实体中分离纯化得水溶性多糖GF3，其13C-NMR有毗喃糖基为1-（103.66ppm），1-6(103.66—70.24),1-3(103.55—86.3),1-4(103.66—80.1)葡萄糖(半乳糖)基存在，均为(3-键型。3）质谱（MS）多糖的质谱分析，主要应用在多糖甲基化水解产物的鉴定，常用GL-MS联用，分析单糖甲基化产物的性质，推测多糖中单糖的排列顺序，主链，侧链及连接点。6、多糖结构分析的化学方法1） 完全酸水解：中性多糖采用稀硫酸（1~1.5M），100°C加热2~4小时，含有己糖醛酸的酸性多糖较难水解，则要用三氟醋酸或稀硫酸、稀盐酸在封管内100C加热水解8~12小时，水解产物除去过量的酸及无机离子，可以纸层析或薄层层析检别单糖种类：在用气相色谱时，必须做成三甲硅烷衍生物及糖醇乙酸酯衍生物使之挥发，便于GC分析，GC法不仅能检测单糖种类，还能定量分析组成单糖的分子（摩尔）比。2） 过碘酸及其盐的氧化反应该反应可以选择性氧化多糖中连二羟基或连三羟基，生成相应的多元醇或甲酸，反应在pH=3~5低温（4C），避光条件下进行，每开裂一个C-C键消耗一分子过碘酸。从消耗的过碘酸及其盐的量、甲酸生成量的分析计算，可以测定多糖的苷键位置、直链多糖的聚合度及支链多糖分枝数目等。例如：葡聚糖如以1—2或1—4糖基聚合，过碘酸氧化平均每个糖基仅消耗一分子过碘酸，无甲酸生成；以1—3苷键相连则与过碘酸无反应，以1—6苷键相连或非还原性末端存在，过碘酸氧化每个糖基消耗二分子过碘酸，且有甲酸生成。根据过碘酸氧化后生成的产物可以了解多糖中连二羟基、连三羟基的状况。3） Smith降解鉴于多糖在过碘酸氧化中，产生'二醛”类碎片，往往导致'超氧化”作用。1952年Smith等提供一种方法，用硼氢化钠使多糖被过碘酸氧化产生的醛基还原成相应的羟基化合物，具有这样无环缩型结构的糖苷键，易被很稀的酸完全水解［80］。由于连接键的稳定性不同，产生的寡糖能反映原始糖苷键特征。Smith降解法，实际上过碘氧化多糖的末端分析。本法是过氧化产物还原成多元醇（羟基化合物），在无机酸作用下进行酸水解或部分酸水解。常用的还原剂为硼氢化钠或硼氢化钾，反应完全后于100C稀酸水解，对所生成的丙三醇、赤藓醇及单糖用纸层析或制备成三甲基硅烷醚衍生物进行气相分析。以葡聚糖为例，1—2,1—6苷键聚合或具有分枝末端，Smith降解产物均有丙三醇（甘油）产生，但1—2苷键无甲酸生成；1—3苷键相连，不发生过碘酸反应。Smith降解反应以后，有葡萄糖生成；1—4苷键相连，过碘酸氧化反应后，Smith降解，酸水解产物为赤藓醇。将过碘酸氧化反应与Smith降解的结果综合分析，基本可以确定灵芝多糖的组成的种类、比例、键型及分枝点等。4） 甲基化反应：多糖分子中的羟基与甲基化试剂（二甲基亚磺酰阴离子于二甲基亚砜）反应，然后水解生成部分甲基化的单糖，经甲基化生成衍生物可以推测多糖分子中各单糖间结合位置，并由不同类型甲基化的单糖数目可以推测多糖中重复单元结构的数目、末端糖的性质和分枝点的位置。红外光谱3300cm-1-3600cm-1处无羟基吸收表示反应完全，酸水解后产物可乙酰化或硅烷化后生成物进行气相色谱分析，或GC-MS分析。5） O-糖苷键的稀碱水解（3-消除反应）在灵芝多糖中有糖肽存在时，为了确定糖链与肽链的连接方式，采用温和碱降解，当糖链与肽链的丝氨酸或苏氨酸相连时，3-位羟基之间形成的O-糖苷键对碱不稳定，而N-型糖链在稀碱作用下不能水解。在0.05-0.5mol/LNaOH溶液下温和（0-45C）水解，在反应时加入硼氢化钠，水解后丝氨酸生成丙氨酸，苏氨酸生成a-氨基丁酸。可定性定量测定水解前后丝氨酸、苏氨酸的减少及丙氨酸、a-氨基丁酸的增加值，推测肽多糖中糖链与肽链的连接方式。6） 酶解法利用酶对糖苷键的专一酶解的特性，可以了解多糖中糖与糖之间苷键的构型，常用糖苷酶有P-D-葡萄糖苷酶，P-D-半乳糖苷酶、a-D-半乳糖苷酶、麦芽酶等。何云庆、李荣芷［29］在研究赤芝子实体热水提物中分离出灵芝多糖GLA有免疫调节、抗氧化活性进一步的DEAE纤维素柱分离出三个肽多糖，其中高效液相法测得分子量为14000，红外光谱在895cm-1处有吸收峰，表明为6-毗喃型糖，在3394，1609，1415cm-1有酰胺基特征峰，元素分析有C、H、N，也证明它含肽链。完全酸水解，纸色谱及气相色谱检识，仅有葡萄糖存在。过碘酸氧化，Smith降解，检出丙三醇、赤藓醇，并有甲酸生成。将GLSP3全甲基化，再水解，还原，乙酰后进行GL-MS分析表明葡萄糖基有葡萄糖（1-3）、葡萄糖（1-4）及葡萄糖（1-6）三种连接方式，残基数比为3:1:1,结合光谱分析证明糖链由等比例的6（1-6）、6（1-4）连接，并有多个非还原性末端葡萄糖基存在。肽链部分经氨基酸分析，由14种氨基酸组成，6-消去反应，丝氨酸降解反应前为0.59%，反应后为0.26%；苏氨酸由0.60%减到微量，并在紫外光谱240nm处出现吸收峰，由此证明该肽多糖的肽链是由丝氨酸、苏氨酸与糖链以O-糖苷键相连。2000年孙东平等［83］进行了灵芝菌发酵培养基优化及灵芝胞外多糖的分离纯化的研究。采用正交法研究了不同条件对灵芝菌生长影响，从中选出了灵芝菌液体深层发酵的优化培养基：葡萄糖3.6%，蛋白胨0.4%，pH6.0，酵母膏0.2%，KH2PO40.1%，MgSO47H2O0.05%，VitB10.005%，每升发酵液产菌丝体15.6g，粗多糖0.72g。经葡聚糖凝胶层析对灵芝胞外多糖进行了分离纯化，共有5个组分，并用红外光谱、紫外光谱、气相色谱等手段进一步分析了灵芝胞外多糖的组成。结果表明：灵芝胞外多糖系由甘露糖醇、果糖、葡萄糖通过6-D-糖苷键构成。四、长白山松杉灵芝多糖的分离与结构鉴定。1993年东北师范大学梁忠岩等［75］对松杉灵芝（G