DB65T 4156-2018羊泰勒虫病防治技术规范

羊泰勒虫病防治技术规范Controltechniqueofre2018-12-01发布新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布I1本标准适用于养羊场(户)和动物疾病防治单位对羊泰勒虫病的防控。隶属于顶器复合门(Apicomplexa)孢子虫纲(Sporozoasida)梨形虫亚纲(Piroplasmia)梨形虫目 羊泰勒虫为小型虫体，呈多行性，有圆形、逗点形、杆形等，以圆形最多见。每个红细胞内有1个～4个虫体或更多，以1个～2个最为常见红细胞感染率0.3%～30%(模式图下羊泰勒虫形态观察，于虫体一侧边缘(显微镜下羊泰勒虫形态观察，见图A.2)。4流行病学2发病或发病轻微，但在病的传播上起到关键的作用。该病传播者是硬蜱，它主要寄生于山羊、绵羊，其次是牛，少数寄生于马、野免，也可侵袭人。当携带病原的硬蜱叮咬宿主动物吮吸血液时，病原体以子孢子虫的形态随唾液进入宿主体内，先在淋巴细胞内进行裂殖生殖，裂殖体成熟后破裂逸出并进入红细胞，感染宿主动物。新疆已被证实的媒介蜱虫只有1种，既小亚璃眼蜱，但其他蜱种也可能携带或传播羊泰勒虫病(新疆羊泰勒虫病各阶段形态变化及其宿主动物，见图B.1)。能自然感染的动物有山羊和绵羊，一般以羔羊及引进的羊只最易感，发病率高。在地方流行区，放牧养群中隐性感染羊、带虫羊较易感，病死率低。羊泰勒虫的分布地区已知有非洲、欧洲、俄罗斯、印度、斯里兰卡和西亚等地都有报道，自1958年在我国四川发现羊泰勒虫后，随后在吉林延边地区以及新疆喀什、阿克苏、伊犁地区陆续发现了羊泰勒虫的感染情况。流行呈散发性，在部分地区呈地方性流行，潜伏期4d~12d左右。该病具有明显的季节性，春秋季节多发，而由于气候差异新疆南疆地区开始发病较早于南疆地区。发病期与每年春季的气温和雨水有关，特别是持续高温干旱天气，下透雨以后，温暖潮湿，有利于蜂的活动和病原体的传播。放牧的羊只发生较多，常年舍饲的羊较少发生或不发生。但羊运场低洼、潮湿、粪便长时间不清扫、不消毒，同样适应中间宿主蜂孽生，而造成羊群发病。5临床症状病初潜伏期6d~12d,平均9d,少数急性严重者1d~2d死亡。体温升高到40℃~42℃,稽留热4d~7d。心跳加快，节律不齐。呼吸急促，发鼻蔚色，肺泡音粗励。精神沉郁，食欲减少或消失，反当及胃肠蠕动减弱或停止。有的病羊拉恶臭粥样粪便，混有粘液和血液。个别羊尿液呈短时的暗色混浊或血尿。肢体僵硬，以羔羊最明显，有的羊在行走时一前肢提举困难或后肢僵硬，举步十分困难。有的羔羊发病2d后，四肢发软，卧地不起，强扶起立，也站立不稳。体表淋巴结肿大，以肩前淋巴结最显著，其大小如核桃大至鸭蛋大，触诊时，有的病畜有痛感。眼结膜初充血，继则出现贫血并带轻度黄疽，有时有出血点，体消瘦，血液稀薄。病程12d~28d,病愈后在短期内不易恢复，康复羊对本病有一定的抵抗力。严重者最后极度消瘦，36诊断从疑似病羊、患羊的耳尖、颈静脉采血，用柠檬酸钠缓冲液或1mg/mL的EDTA抗凝备用。采集羊的淋巴结、脾、肾、肝、肺和骨髓等组织，采样羊死亡时间不超过24h,并装于含PBS液体的采样置于低温、密封的容器内运输，并在24h内送达实验室在2℃~8℃条件下，保存时间不超过24h;-20℃,不超过3个月；-80℃,可长期保存。血液样品以常规方法推成血膜片，空气干燥后，甲醇固定1min～2min,姬姆萨染色5min～10min,滴加香柏油，并在100倍物镜下检查，可见羊泰勒虫体(血液型虫体鉴定方法，见附录C.1)。bodies),或称石榴体，即裂殖体，形态呈圆形(组织型虫体鉴定方法，见附录C.2)。红细胞急剧减少，降至500万左右(正常值800万个/mm³~1400万个/mm³);血红蛋白量相应减少；4成5%溶液肌内注射。轻症1次～2次，重症3次，用药间隔24h。按每千克体重2mg～4mg,配成1%水溶液，静脉注射，必要时第2d可重复用药1次。每公斤体重3mg～4mg,加生理盐水或5%葡萄糖1000mL～1500mL,配成0.5%～1%溶液，静h后重复注射1次。用5%～10%葡萄糖或糖盐水500mL～1000mL静脉注。对精神沉郁、心脏衰竭的病羊，化钙100mL或安钠咖10mL～20mL,静脉注射，或用5%葡萄糖500mL、盐酸吖啶黄注射液20mL~入10%葡萄糖注射液250mL～500mL,静脉注射。5次，连用2d~3d。皮下注射1次用药48h后驱杀率达97.5%,药效持续期可达48d。运动场、墙壁等用敌百虫药液彻底喷雾，每个月1次~2次。6各羊场与地方动物疫控部门配合，每年4月~7月发病高峰季节进行蜂病和羊泰勒虫病监测。有一7(资料性附录)图A.1羊泰勒虫模式图82雌蜱吸饱血落地产卵1卵内孵出幼虫幼虫吸血3487569(规范性附录)病原学诊断方法C.1血液型虫体鉴定方法C.1.1主要设备、材料和试剂冰箱、离心机、光学显微镜、体视显微镜、移液器、吸头、离心管、载玻片；无菌注射器或真空采血管、EDTA溶液、抗凝剂、染色液等。从疑似羊类动物耳尖或颈静脉部无菌采血约10mL,分别加入到含有抗凝剂EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取)和不含抗凝剂的采血管内(用于分离血清),-20℃保存待检。加2g瑞氏粉和1.7g姬姆萨尔色素置研钵中，加50mL甘油研磨调成均匀糊状后缓慢加入少量甲醇，研磨片刻将上层液体移入棕色试剂瓶内，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液，如此连续几次，共用甲醇1000mL。每天震荡棕色试剂瓶内液体2次～3次，每次2min～3min,一周后使用效果更佳。加0.3g磷酸二氢钾(无水)和0.23g磷酸氢二钠(无水)置于烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，用磷酸盐缓冲液调pH至6.5～6.8后加水至1000mL。C.1.4.1取采集的血液样品1滴，将血液置载玻片一端，另取一张边缘光滑的推片，让推片边缘和血液接触，使血液全部与推片边缘重合散开，推片和载玻片保持30°,向前平稳均匀推动推片，载玻片上便留下一层薄血膜。C.1.4.2血涂片制成后，待血膜自然干燥后，在血膜表面滴加甲醇进行固定。C.1.4.3待甲醇在空气中干燥后，对血膜进行染色。将姬姆萨染液滴加在血膜上，使血膜被染液覆盖，染色30min。C.1.4.4染色30min后，用清水轻轻洗去载玻片表面的染液，待载玻片表面干燥后用铅笔或标签纸在血膜的另一侧进行编号。在干燥后的血膜表面滴加一滴松柏油，将血膜放在100倍的显微镜下进行观察，当镜下发现与附录A相同的典型血液型虫体即可判定为阳性。C.2组织型虫体鉴定方法C.2.1主要设备、材料和试剂参见C.1.1。C.2.2活体和死亡牛淋巴、组织样品从疑似病羊的颈浅淋巴结进行无菌穿刺，用干燥注射器抽取淋巴内容物；也可无菌采集淋巴结等用于制作抹片样品。病死动物采样时，死亡时间不超过24h,采集脑、淋巴结、心、肝、和脾等脏器组织样品，样品在4℃左右条件下迅速送达实验室。参见C.1.3。C.2.4.1将载玻片轻轻触碰脏器切面或轻推淋巴液使淋巴液在玻片上形成一张薄的膜。C.2.4.2涂抹片制成后，待自然干燥后，在涂抹片表面滴加甲醇进行固定。C.2.4.3待甲醇在空气中干燥后，对涂抹片进行染色。将姬姆萨染液滴加在血膜上，使涂抹片被染液覆盖，染色30min。C.2.4.4染色30min后，用清水轻轻洗去载玻片表面的染液，待载玻片表面干燥后用铅笔或标签纸在涂抹片的另一侧进行编号。在干燥后的涂抹片表面滴加一滴松柏油，将血膜放在100倍的显微镜下进行观察，当镜下发现典型“石榴体”即可判定为阳性。中，6000g离心1min,小心弃去滤液。放置1min,6000g离心1min洗脱DNA。原虫引物名称序列(5'-3')片段长度泰勒虫TE18S-R绵羊泰勒虫T3-R25μL反应体系50μL反应体系10×PCRbuffer(不含Mg²+)5324上游引物F112下游引物R112泰勒虫RCR反应条件：95℃预变性5min;94℃变性30s,53.8℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环；72℃再延伸10min。绵羊泰勒虫RCR反应条件：95℃预变性5min;94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环；72℃再延伸10min。扩增结束后，凝胶电泳检查扩增样品。用1×TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖(含100μl/L荧光染料),在电泳槽中加入电泳缓冲其PCR诊断用试剂详见附录D。检查到目的条带(电泳斑)作为诊断依据，见图D.1。2～4一样品的PCR产物冰上放置30min;42℃水浴锅热激90s,然后立即冰浴5min;无菌条件下加入900μL无抗性的LB液