浮游菌测定操作规程

目的：对不同洁净区环境浮游菌进行监测并规范管理以确保生产环境符合GMP的要求，依据《中国药典》2020年版及《药品生产质量管理规范》等法规，制定本规程。适用范围：适用于生产车间、检验部洁净室（区）的浮游菌监测和洁净度等级的确认。依据：《中国药典》2020年版四部通则9205《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》《药品生产质量管理规范》（2010年修订）《药品生产质量管理规范》（2010年修订）附录GB/T16293—2010《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》责任：质量部（检验）检验员负责监测；质量部（质监）质监员负责监督；内容：所用的仪器、设备和培养基：浮游菌采样器、培养皿、培养基、生化培养箱。培养皿制备：2.1培养皿的处理：将培养皿置于121°C湿热法灭菌20分钟或180°C干热灭菌至少2小时（或取一次性培养皿）。2.2胰酪大豆胨琼脂培养基培养皿的制备：根据监测点的个数，领用所需培养基的量，将培养基置于100C水浴加热至熔化（注意：时刻观察水浴锅的水量，防止水烧干，导致玻璃炸裂，发生意外），冷却至45C（不能急速冷却，将水浴锅设置45C左右，使其自然冷却，以免发生意外）。在微生物检查室内，用剪刀将培养基瓶口打开，将瓶口放在点燃的酒精灯外焰，旋转360°，目的使瓶口周围处于无菌状态，将培养皿盖打开1/3后，将培养基注入培养皿中，每皿约15ml〜20ml，（注意：培养基应均匀铺开，不得有气泡）。倒好后马上盖上培养皿盖，使其自然凝固，以备用。2.3胰胳大豆胨琼脂培养皿的预培养：将制备好的培养皿，倒置于30C〜35C的生化培养箱内，预培养2天，若培养基平皿上无菌落生长，即可供使用。2.4培养皿的盛装、存放：预培养结束后，用不锈钢桶在培养箱内，将培养皿装好（11〜14个/桶），并保证桶上的小孔保持关闭，将平皿置冰箱内，2-8°C保存，并在七日内用毕（使用前检查有无干裂等情况）。测试状态及说明：3.1有空态测试、动态测试和静态测试，空态：洁净室（区）在净化空气调节系统已安装完毕且功能完备的情况下，但是没有生产工艺设备、原材料或人员的状态；静态A：洁净室（区）在净化空气调节系统已安装完毕且功能完备的情况下，生产工艺设备已安装，洁净室（区）内没有生产人员的状态；静态B：洁净室（区）在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后。动态：指洁净室（区）处于正常生产状态，设备在指定的方式下进行，并且有指定的人员按照规范操作。在空态或静态A测试时，对单向流洁净室（区）而言，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后开始；对非单向流洁净室（区），测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始；在静态B测试时，对单向流洁净室（区），测试宜在生产人员撤离现场并经过10min自净后开始；对非单向流洁净室（区），测试宜在生产人员撤离现场并经过20min自净后开始；3.2采样点数目：面积（m2）洁净度级别A级C级D级<102〜322N10〜<20422N20〜<40822N40〜<1001642N100〜<20040103N200〜<40080206N400〜<10001604013N1000〜<200040010032200080020063注：表中的面积，对于单向流洁净工作台，是指送风面口表面积。对于非单向流洁净室是指房间的面积。3.3采样点的位置：采样点一般在离地面0.8m〜1.5m左右布置（略高于工作面）;送风口测点位置离开送风面30cm左右。在关键设备或关键工作活动范围内可增加测点。3.4采样量设置：洁净度级别采样量L/次A级1000C级500D级100监测程序：4.1检测人员进入洁净区检测（人员与物料可通过“人员、物料的缓冲间”进入洁净区）应用消毒剂消毒采样器外表面。4.2监测顺序宜由高级别区域到低级别区域进行，进出入相同级别区域无特殊规定。4.3测试时房间门（区域）应封闭，空态或静态测试时，室内测试人员不得多于2人。动态测试时，除检测人员外，禁止其余人员在测试点1E范围内活动，防止采样过程的污染。采样：5.1用蘸有浓度为75%乙醇的棉球擦拭采样器的顶盖、转盘以及转盘周边，以消毒，开启采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5分钟，然后快速放入除去外盖的平皿，盖上顶盖，设置采样量，再将采样器置于采样点，开始采样（对于单向流或送风口，使采样管口朝向应正对气流方向，离开送风面30cm左右；对于非单向流，安装好三角架，调节高度至少0.8m〜1.5m装采样器，调节倾斜度，使采样口向上），采样后打开采样器顶盖，立即盖上平皿玻璃外盖密闭同时注明标记。5.2采样结束后返回。培养：6.1全部采样结束后，将培养皿倒置于生化培养箱中培养。6.2在30°C〜35°C培养箱中培养，逐日观察结果，时间不少于2天6.3每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。同时每次检测均取1个平皿做阴性对照试验.菌落计数及浓度计算：7.1菌落计数方法：7.1.1用肉眼直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5〜10倍放大镜检查，有否遗漏。7.1.2若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。7.2浮游菌浓度计算：7.2.1用计数方法得出各个培养皿的菌落数。7.2.2每个测点的浮游菌平均浓度的计算：见式（1）平均浓度（个/m3）=菌落数：采样量 式（1）例1.某测点采样时为400L，菌落数为1,则：平均浓度=1：0.4=2.5个/m3例2.某测点采样量为2m3，菌落数为3，则平均浓度=3：2=1.5个/m3结果判定与处理：8.1每个采样点的单个菌落和平均菌落浓度必须低于所选定的评定标准中的界限。8.2在静态测试时，若某采样点的平均菌落浓度超过评定标准，则应重新采样两次，两次测试结果均合格才能判为合格。8.3监测报告于检验完成（或培养到期）当日发至质量管理部（检验），超过警戒限度或纠偏限度应在备注栏中说明并注明检测位置。米样注意事项：9.1应使用检定合格，且在使用有效期内的