上海市临检中心 数字PCR培训课件 4 娄加陶-数字PCR在外周血T790M检测中的运用重庆

数字PCR检测外周血T790M的运用娄加陶上海市胸科医院肺癌治疗策略的变革PreciseTherapyClinicalPathologyMolecularOnocologyMolecularDiagnosticsOnocologyDiseaseGuidedOnocologyPathologyGuidedLess

choices：SurgeryIncreasedtherapeuticoptionsThemutations

ofdriver

genes

astargetsRadiotherapyaccording

todifferent

tumortypesChemotherapyPresented

ByEnriqueta

Felipat2015

ELCC;临床的问题和需求再活检和动态监测困难没有足够的肿瘤组织肿瘤异质性（时间和空间）侵袭性→非侵袭性→静态

动态→单基因

多基因靶向耐药不可避免T790M突变是主要的耐药机制Yu

H

Aet

al.ClinCancerRes2013;19:2240-2247T790M组织检测的空间异质性30位TKI耐药后接受多位点再次活检患者的T790M状态BiopsySite1T790M

BiopsyT790MPatients◆/

◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆

◆◆

Site2◆/

◆◆

◆

◆◆

Patient

1Patient

2Patient

3Patient

4Patient

5Patient

6Patient

7Patient

8LungtumorLungtumorLungtumorBraintumorBraintumorCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSF其中22例匹配的胸部和脑部标本Pleural

effusionPleural

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effusionLungtumor胸部总计脑部+2-+-02Patient

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30101210

2010

22总计LungtumorLungtumorLungtumor一致性

:12/22（55%）Pleural

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effusionPleural

effusionClavicularLNLungtumorLung(primary)LungtumorLungtumorCSFCSFCSFCSFAkitoHata,et

al.JTO,

2015CSFPleural

effusionLung(meta)Pleural

effusionPleural

effusionSkintumorPleural

effusionClavicularLNPericardialeffusionAbdominalLNLungtumorLungtumorLungtumorT790M组织检测的时间异质性24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均检测T790M突变状态5位患者停止

TKI

治

疗一段时间后，T790M

状

态从阳性变成阴性实时监测的必要性！1位患者在接受高剂量的厄洛替尼后脑脊液的T790M

由

阴性转阳性➔

×

➔:代表接受TKI治疗；⇒：代表停止TKI治疗A

：阿法替尼；III

：三代TKI；B

：贝伐单抗；H-E：高剂量erlotinib；G：易瑞沙AkitoHata,et

al.JTO,

2015耐药T790M突变检测挑战？

373例初治的患者，298例患者存在T790M突变，比例高达约80%

突变丰度<1%的患者比例为98%，突变丰度>1%的患者比例仅为2%；高灵敏度检测方法的必要性！Masaru

etal,ClinCancer

Res(2015)二、如何做？1、样本来源多种样本的获取方式和优缺点1.

组织活检（肿瘤蜡片）2.细胞学标本（恶性胸水）3.血液标本（ctDNA)样本品质和肿瘤细胞含量可能比组织样本较低当无法获取组织或细胞学样本时，作为有效补充过往的检测金标准DNA

片段/假阴性较多，需要高敏感度方法-+-+-侵入性每个病人都适用++--动态检测对于组织和胸水都取不到的患者，血液样本是一个很好的补充Pirker

Retal.JThorac

Oncol2010;

Savic

Setal.BrJCancer

2008;

Rekhtman

Netal.JThoracOncol2011;Tanaka

Tetal.CancerSci2007组织/细胞学检测是目前的金标准，但仍有局限部分患者无组织标本或无足够的组织标本进行基因检测由于肿瘤异质性，重复活检和动态检测困难仅根据初诊时标本指导后续治疗可能产生偏倚1.

Pirker

Ret

al.

JThoracOncol2010;5:1706–1713;2.

MarchettiAand

Normanno

N.Patholgica

2010;102:119–122;3.

Eberhard

Detal.

JClinOncol2008;26:983–994;4.

KimuraHet

al.

BrJCancer

2006;95:95:1390–1395;5.

OshitaFetal.

BrJCancer

2006;95:1070–1075;血液检测的优势指导用药匀质标本实时监测作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药循环而匀质的血液标本，在一定程度有效克服异质性实现实时动态监测，提高全程管理水平1.

Molina-VilaMetal.

JThoracOncol2008;3:1224–1235;2.Smouse

Jetal.

Cancer

Cytopathol2009;117:67–72;3.

VanEjikRet

al.

PLoSOne2011;6:e177791;4.

Rekhtman

Net

al.

JThoracOncol

2011;6:451–458EGFR基因突变血液检测共识2014年欧洲药品管理局：当难以获取肿瘤组织样本时，可采集外周血作为补充标本评估EGFR基因突变，以明确吉非替尼治疗中受益的患者2015年《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》：肿瘤组织仍是优先选择的生物样本，但难以获取时血液可作为合适的替代生物材料《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》.中华医学杂志,

2015.二、如何做？2、检测平台血液EGFR检测方法技术手段ARMS第二代ARMS

（superARMS）Nestedreal-timePCRDropletDigitalPCRMicrofluidicDigitalPCRCOLD-ddPCRNanofluidicDigitalPCRBEAMingDigitalPCRcastPCR（Competitive

AlleleSpecific

TaqMan

PCR）Clamping

PCRSynchronous

TES（thermal-electrophoreticseparation）NGSInt.

J.

Mol.Sci.2015,

16,14122-14142ARMS,

digital

PCR,NGS的比较ARMSDigital

PCRNGS单一基因/已知突变位点单一基因/知突变位点已

多个基因/测序长短可知或未知突变位点<5%(依照检检测灵敏度下限数据能否量化试验操作难度数据解读难度报告准备时间是否已批准上市1-5%<0.1%可量化++测序列不同而异)半定量标准基线校正)(需有可量化+++++++++(专业实力差距大)2-3周2-3天+3-4天伴随诊断VVVV动态监测V(需有标准基线校正)V临床应用新靶点探寻耐药机制探寻病人生物标记物VV单一靶点单一靶点多靶点ARMS-PCR仪器平台------适用多种主流的荧光定量PCR仪器试剂盒----

组织血液均获批，适用样本类型多（新鲜组织，石蜡组织，胸水，血液）灵敏度：对同一份突变含量低至1%的DNA样品进行10次重复，均能检出试剂盒名称是否获批用途及特点组织CFDA和CE认证ADx-EGFR

mutationCFDA和CE认证ADx-EGFR

mutationin

ctDNA血液ADx-SuperARMS尚未获批单点T790M检测DropletDigitalPCR整体原理：“分而治之”（divide

and

conquer），灵敏度高，适合稀有DNA片段检测DilutionDistribution

Amplification

QuantificationNGSctDNA提取及质量检测文库制备及质量控制测序文库质量检测测序及数据分析NGS和ddPCR都能够报告等位基因突变频率，反映不同亚克隆的比例关系NGS和ddPCR都是通过计算，看检测出多少带有突变的DNA（突变型），和检测到的所有的DNA（野生型+突变型）的比值来确定等位基因突变频率（AF）。•

等位基因突变频率=4/14=28.5%•

未突变的DNA来自正常组织或肿瘤中的其他亚克隆EGFR

L858通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异质性有帮助。NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类•

MET14exon

skipping，HER2

20exon

insertion等情况复杂的突变•

EGFR等热点基因的非热点突变位点•

ALK等热点基因的非常见融合方式•

罕见的EGFR-19Del

可能会造成PCR方法假阴性约3/4

ALK融合为经典的EML4-ALK融合，但有1/4为与其他基因的融合，包括：•

STRN-ALK•

CATSPERB-ALK•

ACVR1-ALK•

CLIP1-ALK•

DPH6-AS1-ALK•

KIF5B-ALK•

RP11-320M2.1-ALK•

UGP2-ALK二、如何做的准？自建系统性能确认实验室自建分子诊断项目的基本要求(2016)准确性实验室资质及环境精确性监管实验室人员要求实验室管理要求参考范围可报告范围分析灵敏度性能确认性能确认质量控制试剂耗材质量室内质控、室间质评分析特异性临床验证中国医师协会检验医师分会分子诊断专家委员会：《实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识》血液EGFR基因突变检测流程微滴阅读结果分析生成微滴PCR扩增血浆分离（两次离心）4℃

1600g

10min4℃

16000g

10minQX200™

Droplet

Digital™

PCR

系统样本检测核酸抽提QIAampCirculatingNucleic

AcidKit（55114）PCR反应体系配置ddPCRTM

Supermixfor

Probes;PrimePCRTMddPCRTM

MutationAssayQCQuibit

3.0分析前质量控制-样本处理方法：选择早期和晚期临床肺癌患者各3例，2h内分离血浆，每个病人血浆均分成2mL的4等份，以4个不同公司的试剂盒进行血浆游离DNA抽提，qubit比较其浓度，2100检测相应的纯度。公司A公司BctDNA浓度比较公司A公司B10008006004002000公司C公司D公司C公司D不同临床分期的血浆样本早3血浆抽提2100检测cfDNA条带分布空白检测限(LOB)方法：对20名健康人外周血3个EGFR基因位点（19del、T790M、L858R）突变情况进行检测，结果突变微滴数目均在0-1之间，利用检测结果绘制泊松分布图，并以其95%置信区间上限作为参考上限，设定空白检出限。阳性判断标准：

ch1+ch2-

微滴数≥21

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.019-Del1

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.0L858RT790MLOB=11

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.0LOB=1LOB=1024681

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Submission准确性64例晚期非小细胞肺癌血浆样本与ddPCR结果与NGS比较：一致性良好。NGSConcordanddPCRKappay=0.3827x+0.0106R2=0.8894+—ce（%）0

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.0+—+111250119-DelsL858RT790M95.310.8510.9130.93814196.8898.44—+4800

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CR—154Guo

qiaomei,

etal,Oncotarget,insubmission精密度方法：选取高低2个浓度标准品（突变比例分别为1%、0.1%），每天测定3次，连续5天进行精密度评估，精密度小于15%视为符合要求。1%标准品0.1%标准品19-Dels5.91%L858RT790M19-DelsL858RT790M3.52%8.60%9.80%8.61%14.63%批内精密度（%）批间精密度（%）12.34%12.44%12.33%14.12%14.74%8.65%线性范围方法：以野生型A549细胞系DNA对突变型细胞系DNA进行稀释，制备突变比例为50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的标准反应模板，得到的结果以预期结果作横坐标，以实际观测结果为纵坐标，做线性评估，回归系数R2>0.99可判断为线性。1

9

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qiaomei,

etal,Oncotarget,insubmission分析灵敏度方法：将1%突变比例的标准品采用野生型标准品依次稀释为0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度，每个位点每种突变比例下设置20个反应。要求CV%<20%。（nX

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×100%CV(%)19-DelL858RT790M1%0.5%13.2114.6412.160.1%16.4314.5213.020.05%19.1214.5636.197.37.9910.50

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)InSubmission分析特异度突变比例（突变型/野生型）DNA模

板19-Del0/1780T790M0/1840L858R高浓度野生型基因组DNA中浓度野生型基因组DNA0/19000/79600/74000/7720低浓度野生型基因组DNA0/137800/138000/14420-L858R

/T790M阳性细胞系0/11720--DNA19-Dels

阳性细胞系DNA