广西临检中心 微生物质量控制会议课件 侵袭性真菌病实验室诊断进展

侵袭性真菌病实验室诊断进展南方医科大学附属第二医院龙

军提

要„

真菌的分类–

真菌感染的流行病学–

侵袭性真菌病的特点–

侵袭性真菌病的诊断进展–

病例介绍–

小结真菌的分类„

真菌的基本形态和分类:1.按菌落形态分类:„

（1）霉菌„

（2）酵母„

（3）双相型真菌真菌的分类„

真菌的基本形态和分类:按致病性分类(1)病原性真菌(2)条件致病性真菌按致病范围分类(1)浅部真菌(2)深部真菌致病性真菌„

球孢子菌、副球孢子菌、组织胞浆菌–

外源性感染–

可侵犯免疫功能正常者–

地区分布（南美洲、中北美洲）条件致病性真菌–存在于空气、土壤–分布于人体的皮肤、口腔、鼻咽、消化道、生殖道和医疗器械中–念珠菌、曲霉、隐球菌和毛霉菌多见–与抗生素、免疫抑制剂和恶性肿瘤的放化疗等有关曲霉菌的菌形态黑曲霉土曲霉烟曲霉黄曲霉毛霉菌落假根接合孢子孢囊孢子提

要–

真菌的分类„

真菌感染的流行病学–

深部真菌感染的特点–

深部真菌感染的诊断进展–

病例介绍–

小结感染是一个永远都不能忽视的话题感染病原菌的动态变化„

感染原包括：细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等„

60年代：革兰氏阳性菌感染为主„

70年代：革兰氏阴性菌感染为主„

90年代迄今：深部真菌的感染逐渐增多，USA近10年增加2倍耐药菌株增多（细菌和真菌）少见的病毒的出现：禽流感和SARS等免疫缺陷病如AIDS发病的增多白血病和再生障碍贫血增多过去20年院内真菌感染发生率500%Data

from

Lewis

&

Klepser.

Am

J

Health-Syst

Pharm.

1999.近年国外致病菌感染的分离率----院内菌血症中重要致病菌分离率（%）致

病

菌凝固酶阴性葡萄球菌金黄色葡萄球菌肠球菌NNIS(14424)

SCOPE(2596)

EPIC(247)3116932.316.610.644.921.910.9真菌8554338.16.55.55.15.33.19.36.5-大肠杆菌肺炎克雷白菌肠杆菌属假单胞菌属链球菌-9.7-NNIS=全美院内获得性感染调查系统；SCOPE=致病菌流行病学调查和控制；=全美院内获得性感染调查系统；

=致病菌流行病学调查和控制；EPIC=欧洲ICU感染患病调查欧洲ICU感染患病调查中国5家医院98-03年临床分离的2387株酵母菌70656055％50454035302520151050侵袭性曲霉病死亡率逐年上升1980-1997年美国侵袭性真菌感染的死亡率8念珠菌其它真菌曲霉菌0.60.40.20.019811986199119968.McNeilMMetal.ClinInfectDis.2001；33：641-647.提

要–

真菌的分类–

真菌感染的流行病学„

深部真菌感染的特点–

深部真菌感染的诊断进展–

病例介绍–

小结真菌感染的特点♠

“二高、二低、一快”)院内感染率高、死亡率高)临床诊断率低、实验室诊断率低)病情恶化快高发病率和高死亡率Nosocomial

bloodstreaminfectionsinhospitalsintheUSA重要致病菌流行病学监测和控制（SCOPE）计划

1995-1998排名病原数量分离率死亡率12凝固酶阴性葡萄球菌金黄色葡萄球菌3908192831.9%15.7%21%25%3肠球菌属135411.1%32%4

念珠菌属9347007.6%5.7%40%24%56大肠埃希菌克雷伯菌属肠杆菌属6625.4%27%75574.5%28%8铜绿假单胞菌锯杆菌属5424.4%33%91771.4%26%10链球菌属1731.4%23%Edmond

et

al.

Clin.

Infect.

Dis.

(1999).

29:239-244PUMCH4年的医院内血液感染的监测菌血症死亡率（1990-2003）44.1454035302520157.6105059例念珠菌104例细菌赵心懋

徐英春

PUMCH

Data

2005临床和实验室诊断率低„

85%无法获得及时和正确的诊断、治疗„

50%血培养呈阴性50%85%Carlson

R.

Oncology

Times

Jan,

1992;16,17,

45Holmberg

K.

Raven

Press

1989:

36-46病情恶化快„

诊断后48小时内死亡率40%„

两天以上患者死亡率78%78%40%Nolla-Salas

J,

Sitges-Serra

A,

Leon-Gil

C,

et

al.

Intensive

Care

Med

1997;23:23-30尸检发现50%播散性念珠菌病生前血培养阴性。北京协和医院1953-1993年间3447例尸检，发现深部真菌感染85例，其中生前明确真菌感染诊断者仅5例，占5.9％，漏诊率高达94.1％。如何早期诊断侵袭性真菌病提

要–

真菌的分类–

真菌感染的流行病学–

深部真菌感染的特点–

深部真菌感染的诊断进展–

病例介绍–

小结侵袭性真菌病的诊断宿主

临床

真菌学

组织学确诊：

+

+

+临床：

+

+

+疑诊：

+

+

-+--宿主危险因素„

中性粒细胞减少症:中性粒<500/mm

超过310天„

合理应用广谱抗生素后仍持续发热超过96小时„

体温>38℃或<36℃，在此之前有下列情况存在:此前60天内,长时间中性粒细胞减少(>10天)最近或当前(60天内)正在使用免疫抑制剂有过深部真菌感染病史症状或体征表明有对移植物的排异反应长期使用糖皮质激素(>3周)临床特征－主要特征①侵袭性肺曲霉菌感染的X线胸片和CT影像学特征„

早期出现胸膜下密度增高的结节实变影„

数日后病灶周围可出现晕轮征„

约10～15日后肺实变区液化、坏死，

出现空腔阴影或新月征（放线菌、结核菌、奴卡氏菌等也会阳性）②肺孢子菌肺炎的胸部CT影像学特征„

双肺出现毛玻璃样肺间质病变征象„

伴有低氧血症胸部

CT扫描影像的演化晕轮征气腔实变新月形空气透亮征D0-5D5-10D10-

20Caillot

et

al

2001急性侵袭性肺曲霉病影像学表现高分辨CT检查对早期诊断重要微生物实验室检查„

直接涂片„

培养„

真菌抗原检测„

分子生物学技术真菌标本镜检„

是最简单也是最有用的实验室诊断方法„

其优点在于简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，阴性结果亦不能排除诊断„

可采用不染色的湿片如KOH涂片或Gram染色涂片。„

如在无菌体液的直接镜检中发现真菌常可确立深部真菌病的诊断。直接涂片1„

肠道和口咽部涂片„

念珠菌是正常人体胃肠道和咽部的正常菌群，所以不能以这些部位涂片见到孢子或培养出念珠菌即作为真菌感染依据必须与临床表现相结合来确定诊断。„

从支气管肺泡灌洗液检查卡氏肺孢子虫是确诊的重要依据直接涂片2有意义的涂片结果•机体内部标本如血液、腹水、C5F、脓肿穿刺液等•新鲜尿液见到大量菌丝及孢子•组织真菌涂片直接镜检患者痰、喉或气管分泌物阳

性率为10%到30%。微生物培养技术„

有意义的真菌培养标本„

非经口痰标本„

非插管尿标本血液或其他无菌体液(胆汁、胸腹水、脑脊液）微生物培养技术和进展„

无菌部位采集的标本(如血,CSF、胸腹水、关节液等)中分离的任何酵母都必须鉴定到种，均有诊断意义。„

同一部位反复分离出同一菌种也具重要意义。„

从非无菌部位(粪、痰、咽拭等)分离到的条件致病菌(如白念珠菌)，如直接镜检大量菌丝(+)，须结合临床认定具致病性血培养排名前10位的临床致病菌细菌名称金葡正确污染率6.4不确定6.487.299.312.40.00.7大肠埃希氏菌凝固酶阴性葡萄球菌肺克81.90.05.8100.069.90.016.11.814.01.8肠球菌96.4绿脓100.090.00.00.0肺链0.010.012.70.0白念38.049.30.0草绿链100.0阴沟培养方法缺点分泌物培养检验真菌，至少75%的患者会漏诊。☆缺点：耗时长,阳性率低，血培养1/3标本早期不入血。LevinsonW,JawetzE.Cutaneousandsubcutaneousmycoses.In:Medicalmicrobiologyandimmunology:examinationandboardreview.5thed.Stamford(CT):Appleton&Lange;1998.33.BrownMJ,etal.Invasiveaspergillosisintheimmunocompromisedhost:utilityofcomputedtomographyandbronchoalveolarlavage.ClinRadiol1998,3(4):255-257微生物学检查：中华内科杂志编辑委员会标准1.合格痰液经直接镜检发现菌丝，真菌培养2次阳性（包括曲霉属、镰刀霉属、接合菌）；2.3.支气管肺泡灌洗液经直接镜检发现菌丝，真菌培养阳性；合格痰液或支气管肺泡灌洗液直接镜检或培养新生隐球菌阳性；4.5.6.7.支气管肺泡灌洗液或痰液中发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体；血液标本曲霉菌半乳甘露聚糖抗原（简称GM）（ELISA）检测连续2次阳性；血液标本真菌细胞壁成分1,3-β-D葡聚糖（G试验）连续2次阳性；血液、胸液标本隐球菌抗原阳性。血液标本真菌抗体测定作为疾病动态监测指标有临床意义，但不能用于早期诊断。血液标本各种真菌PCR测定方法，包括二步法、巢式和实时PCR技术，虽然灵敏度高，但容易污染，其临床诊断价值有待进一步研究。隐球菌检查现状—抗原检测„

目前检测方法少，检出率低„

死亡率高„

艾滋病人和移植病人感染率高„

抗原检测很重要微生物检查技术和进展„

检测新生隐球菌的荚膜多糖抗原„

诊断及推测隐球菌病的预后•

99%中枢神经系统隐球菌感染者为阳性•

90%非中枢神经系统(肺﹑肾)隐球菌感染者为阳性•

检测其滴度可反映治疗效果及其预后目前认为此法能早期﹑快速诊断隐球菌病，大多数患者抗原阳性后培养才继之阳性但还没有申请“三证”曲霉菌检查技术进展„

在曲霉感染的免疫学诊断中倍受青睐•

标本可取血清、尿液、脑脊液及BAL液等•

被检测的抗原成分主要是半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)

脂多糖„

GM在感染后24h即可检测出，与病情严重程度一致•

常用的是ELISA、RIA和乳胶凝集试验等•

敏感性和特异性因方法而异曲霉半乳甘露聚糖抗原测定„

曲霉抗原乳胶凝集试验:特异性：90-100%；敏感性：55%左右曲霉抗原ELISA试验:特异性：>80%；敏感性：50-80%但无三证，制约了广泛开展。国内已开展抗原检查技术„

血浆ß－1，3－D葡聚糖检测（G试验）目的：通过测定血浆、体液及支气管肺泡灌洗液中真菌细胞壁成分（血浆ß－1，3－D葡聚糖），诊断侵袭性真菌病原理：利用鲎的G凝血因子被ß葡聚糖激活后形成凝固蛋白，以浊度定量标本中的真菌ß葡聚糖浓度微生物检查技术和进展„

假阳性:„

运用纤维素膜进行血液透析患者、某些纱布或其他医疗用品中含有葡聚糖、某些静脉制剂含葡聚糖、某些细菌败血症患者(链球菌)、使用安美汀、氨卞西林/舒巴坦、磺胺类抗生素者；使用真菌孢子粉治疗药物等。„

动态监测可避免假阳性„

已有“三证”微生物培养技术和进展„

现在国内已有生产厂家且北京、上海、天津、广东、河北、四川等已有定价收费项目„

两种实验比较:国外研究表明：两种试验敏感性、特异性相当，其出现阳性的时间稍早于半乳甘露聚糖抗原，两者均早于影像学出现改变，联合检测可提高特异性JClinMic

，

2005，

43:299-305„

C:\DocumentsandSettings\Administrator\桌面\1→3-β-D-葡聚糖基质显色法在成人中性粒细胞减少患者侵袭性曲霉菌病的诊断和治疗性监测中的地位：与循环半乳甘聚糖系列筛查的比较.ppt定量测定1-3-β-D-葡聚糖的意义„

早期诊断：侵袭性真菌病增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对侵袭性真菌病治疗成败的关键在于早期诊断。„

快速诊断：真菌感染就医的患者，往往病情严重，传统的微生物分离、培养与鉴定需要时间较长，患者在等待期间有可能病情加重，甚至死亡。„

指导用药：快速确定真菌感染后，积极使用抗真菌药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格昂贵的药物提供准确的依据。„

评价用药：应用抗真菌药物后，检测葡聚糖变化，评价选用药物的正确性。„

监护病程：监护侵袭性真菌病易感人群的病发状态。„

动态观察：易感人群，临床疗效定量测定1-3-β-D-葡聚糖的设备„

MB-80微生物快速动态测定系统：主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等。定量测定1-3-β-D-葡聚糖的设备„

T01智能恒„

真菌检测„

无热原平尿杯定量测定1-3-β-D-葡聚糖特点„

样品来源：血浆，血清，腹水，尿液，脑脊液„

测定葡聚糖可以很快得到结果，在实践中不必等待真菌培养的结果，对临床医生采取积极的治疗提供依据。„

动态快速检测，不受血中抗生素和酶等的影响。„

所有真菌(除接合菌外）的细胞壁上都含有1-3-β-D葡聚糖，而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分，因此在机体的体液中检测到1-3-β-D葡聚糖是诊断侵袭性真菌病的有效依据。„

不能确定菌种，但能肯定是否有真菌感染。指导临床科学合理的使用抗真菌药物。当检测到标本中葡聚糖含量较高时，即刻予以系统治疗，不必等鉴定出种属。定量测定1-3-β-D-葡聚糖的原理1-3-β-D-葡聚糖全过程2小时内完成，可及时提供结果，指导临床因子G活化因子G凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白动态浊度法定量测定1-3-β-D-葡聚糖的原理„

不同浓度反应体系引起不同的浊度变化，当透光率达到法线时，该时间的对数（LgTg），与葡聚糖的浓定量依据度（LgC），呈直线关系定量测定1-3-β-D-葡聚糖的设备国内外现状国外现状国内现状„

美国、日本等国均已出现专用的1-3-β-D葡聚糖检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得„

MB-80微生物动态快速测定系统（金山川公司）„

首家获得SDA认证„

普及面广,影响大.„

国内独创专利产品计算机软件著作权FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。„使用MB-80的临床评价关于真菌葡聚糖试剂的比对试验--------------------------------------------------------病人细菌培养结果金山川试剂--------------------------------------------------------和光试剂65/M76/M22/F75/M81/M78/F61/M68/F白色念珠菌热带念珠菌毛霉菌86.236.2480.9265.131.554.222.48.684.633.5476.6235.436.255.720.25.6烟曲霉菌热带念珠菌光滑念珠菌白色念珠菌近平滑念珠菌--------------------------------------------------------分子生物学技术„

目前缺乏标准化的方法„

WHite运用实时定量PCR方法对203例血液病患者全血标本进行曲霉检测，结果发现在确诊/高度拟诊的患者中，阳性率为92.3%;与G实验和GM实验及高分辨CT有良好的一致性分子生物学技术„

台湾学者运用液相芯片技术，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可变的内部转录间隔区(ITS)，前者用于筛选真菌感染，后者用于菌种的确定，同时对64种真菌进行鉴定，敏感性和特异性均大于97%，

1天内完成„

JClinMic2005,43:3760-3768分子生物学技术„

存在问题„

1.外来的污染„

2.不能有效地区分定植和感染„

3.不能指导临床何时开始及停止抗真菌治疗„

4.不能取代培养和组织切片及抗原定量检测方法提

要真菌的分类真菌感染的流行病学深部真菌感染的特点深部真菌感染的诊断进展病例介绍小结使用MB-80的临床评价„

第四军医大学西京医院检验科MB-80微生物快速动态检测仪研究侵袭性真菌病患者血浆1-3-β-D葡聚糖检测与临床意义时发现：„

正常对照组血浆1-3-β-D葡聚糖含量为2.83±2.57pg/ml；侵袭性真菌病组为54.06±36.13pg/ml。经t-检验分析，对照组与侵袭性真菌病组1-3-β-D葡聚糖平均值差异非常显著（t=7.741,P＜0.001）。„

血浆葡聚糖检测可在拟诊早期为临床医生提供是否感染真菌的可靠信息，是一种实用的侵袭性真菌病早期诊断方法。---------中华医院感染学杂志,2005,15(3):354-355175例G实验阳性结果分析科

别

均值例数血阳率

血阴率

血阴治疗

准确率有效率重症科

227.775703013583儿科1172.2

3871.436528.573576.4373呼吸科

123.6血液科

217.825238752513388肿瘤科

4422.5

14831786重症监护病房75例分析696次696人总例次总人数>60ug/

75次

确诊*临床诊

54人L断<60ug/

62113人拟诊L次确诊*：血培养有真菌生长，有宿主因素结果分析确诊或临

无真菌感染床诊断或拟诊67例次

627例次共计例次>60ug/L

54例次

19例次<60ug/L

13例次

608例次223.7

18.5709.3

50.7158.2

10.10

05平均值标准误标准差P病

例„

患者

：男，65岁，2008年9月4日入院„

主诉：反复咳嗽、可咳痰、胸闷、气促5年加重伴发作2天。„

病史：5年前无明显诱因出现咳嗽，阵发性、频繁、黄色脓痰血色泡沫状,量中,胸闷气促加重等。„

08-09-05CR：1.两上肺纤维钙化肺TB，两上胸膜增厚粘连。„2.两肺肺气肿„

08-09-8、08-09-12、08-09-15CR：„„„1.两上肺纤维钙化肺TB，并局部支扩及两上胸膜增厚粘连。2.两肺肺气肿合并两肺大泡形成病

例08-09-6CT：„

1.两上肺、右中叶、右下肺背段慢性感染（拟TB感染可能）并收缩不张，支扩„

2.两肺气肿，多发肺大泡其中右上肺大泡内可疑曲菌球形成。„

检查：+C-

TB

-„

痰涂片：见G

，真菌（

）、

（

）„

G试验：265pg/ml（两次均值）病

例„

诊断:„

1.双肺支气管扩张并感染„

2.双肺多发肺大炮形成„

3.右上肺曲菌球病例„

治疗：用伏立康唑标准剂量治疗7天，后改为大扶康治疗，痊愈出院。G实验存在问题„

假阳性„

假阴性：联合GM实验并接合临床。„

参考值范围，20、50、60、80。„

不能区分属和种，但并不影响治疗。抗真菌活性的比较两性霉素B氟康唑

伊曲康唑

伏立康唑

PCZRCZ

卡泊芬净MFAF真菌白色念珠菌热带念珠菌近平滑念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌新型